使用自动图像分析对啮齿动物模型的亚斯坦蒂娅尼格拉多巴明神经元密度进行半定量测定

估计亚坦蒂亚尼格拉的多巴明神经元数是帕金森病研究的关键成果指标。此协议显著缩短了估计神经元数量所需的工作量。该方法为检测多巴明神经元数的变化提供了一个时间高效、准确的过程，适合确定干预对细胞生存的影响。

这种方法可以很容易地适应，以提供不同大脑区域的神经元的准确计数，同时保持成本和时间优势比传统的固态方法。要捕获 IHC 图像，请使用该软件与 10 倍放大倍数的对焦显微镜耦合。将针孔打开至 1.5 个区域单位，以捕获总长 1.5 微米的宽平面，并将焦点放在大脑的注射侧。

在获取选项卡上检查磁贴扫描成像选项，并将尺寸设置为 10 乘 4。在采集模式面板下将变焦设置为 1.1，以避免磁贴扫描图像之间的任何缝合标记。将帧尺寸设置为 1024 x 1024 像素，平均值设置为 2，以确保高质量的图像采集。

在通道面板设置轨道一到亚历克萨 488 和轨道二到亚历克萨 555 。将幻灯片加载到舞台上，并选择具有强 TH 染色的部分。点击收购面板上的实时直播。

在通道面板中，将激光强度和增益设置为最大化信号和限制背景噪音的水平。使用范围指示器确保信号不会过度暴露。使用多个幻灯片重复此步骤。

在收购选项卡上检查位置框。要开始成像，请使用眼片并选择显示正 TH 染色的第一部分。然后将焦点设置在兴趣点，并将舞台移到部分的中线。

这样可以保存 X、Y 和 Z 轴中的位置，并将对捕获整个部分的瓷砖扫描进行成像。对于所有其他幻灯片（包括未注入的站点）重复此步骤。使用适当的软件将图像文件单独导入自动图像分析软件。

通过选择笔注释工具来在基坦蒂亚尼格拉平价紧凑物周围绘制注释，从而定义感兴趣的区域。移动到分析选项卡，并从下拉分析菜单中选择实时调整。这将打开部分图像上的单独窗口，以便实时修改分析参数。

在分析放大部分下选择合适的图像变焦。在细胞检测部分下选择核染料作为用于TH染色的染料。调整核对比阈值、最低核强度、核分割侵略性和核大小设置，同时仔细观察时间调整窗口。

使用多个示例重复此过程。一旦采样了适当数量的图像，并相应地调整了实时调整，将"设置"中的分析设置保存在"下拉"菜单中。选择要分析的所有图像并单击分析。

选择刚刚保存的分析设置，并在分析窗口区域检查注释层框，然后检查第一层并单击分析。完成导出所有部分的汇总分析数据后，选择导出对象分析数据的选项。此数据集可用于检查细胞大小的变化，以响应毒素或治疗。

腺相关病毒或 AAV 注射六周后，AAV 向大鼠大脑中的亚坦蒂亚尼格拉注射表达突变 A53T 阿尔法核糖核素的立体定向注射，导致多巴明神经元的密度显著降低。与注射AAV空向量的老鼠相比，注射AAV-A35T的老鼠的亚坦蒂亚尼格拉每毫米TH正神经元的平均数量显著减少。类似的观察也使用公正的立体学。

当尝试此协议时，请记住，软件只有经过培训才能使用。因此，必须花时间和照顾，以确保一个单元格被确定为单个细胞。该软件可以适应测量其他感兴趣的蛋白质的荧光强度，如α-核素，以确定治疗是否可以调节蛋白质水平。

这项技术在测试多种潜在治疗方法对多巴明神经元密度的影响时，效率更高。