这种方法可以帮助回答生殖领域的一个关键问题，即遗传调节过程如何以及何时影响卵巢储备的大小，我们知道卵巢储备的大小会影响女性，生殖寿命该方案可以用于大规模研究，使用相同的技术对来自不同发育阶段的完整卵巢。它通过提供生殖细胞的有效定量来生成可生成的数据。这种方法应用于同一物种的遗传多样性动物可以提供直接遗传因素和生殖细胞发育等发育器官的洞察。
来自我实验室的研究实习生Nathaniel Boechat将展示该程序，从丰富的步骤开始，并通过以放松的位置将所有腿通过爪垫轻轻地固定在板上，将麻醉的青春期雌性小鼠固定在其背部。要打开小鼠的胸腔，小心地切开肩胛骨正下方胸骨两侧的肋骨，避免刺穿肺部，用镊子抓住皮肤或肋骨瓣，并用夹住皮瓣以暴露内脏，使用解剖剪刀剪断心脏的右心房并从系统中释放血液。然后用镊子握住心脏，将灌注针插入左心室，并以温和恒定的压力泵送10毫升PBS。
当肝脏肾脏和生殖道等组织从粉红色变为白色时，用新鲜制作的1%多聚甲醛或PFA代替PBS，并继续灌注约10毫升PFA。接下来，将带有卵巢的脂肪垫定位在肾脏下方，并轻轻解剖整个生殖道，包括脂肪垫卵巢和子宫角，将其放入具有4%PFA的小瓶中。在室温下固定卵巢16至24小时，然后用70%乙醇替换4%PFA。
在染色当天修剪卵巢，然后进行免疫染色。在免疫染色方案的第一天，将每孔一毫升PBS移液到清洁的24孔板中所需数量的孔中。切下1000微升移液器吸头的尖端以形成宽开口，并使用宽尖端将带有70%乙醇的小瓶中轻轻地将青春期卵巢转移到孔中，然后用新鲜的0.8毫升PBS替换孔中的PBS第二天从孔中吸取PBS以每孔0.8毫升渗透缓冲液代替它。
在室温下将板在振荡器上孵育四小时后，用封闭缓冲液替换渗透缓冲液在第三天，通过在封闭缓冲液中稀释来制备一抗。可视化卵母细胞将产前和青春期前卵巢与卵母细胞标志物一起孵育。在第八天用新鲜的洗涤缓冲液洗涤样品两小时，然后用0.5毫升在封闭缓冲液中稀释的二抗混合物替换洗涤缓冲液。
用parafilm密封板以防止蒸发，并将样品在室温下在黑暗中孵育三天。在免疫染色洗涤后的第11天，吸出洗涤缓冲液，并将样品与0.8毫升刻度立方一溶液在37摄氏度下在黑暗中孵育三天。每天更换比例立方一溶液。
在第15天，在室温下洗涤样品三次10分钟和0.8毫升PBS，轻轻摇动。然后用0.8毫升新鲜制备的脱气20%蔗糖用PBS代替PBS，然后在室温下轻轻摇动。如前所述，一小时后，更换20%蔗糖溶液，用0.8毫升立方二溶液处理样品四至五天。
为了准备样品设置，使用带有尖端截止的200微升移液器吸头将带有15至20微升刻度立方二溶液的耻骨卵巢转移到粘合剂孔的中间。一旦卵巢被转移到单个孔中，用一滴清除溶液轻轻地将盖玻片放在粘合剂孔上并按压以形成一个密封，将样品和清除溶液夹在两个盖玻片之间。对于成像场所，盖子将三明治夹在3D打印的显微镜适配器载玻片中。
根据显微镜芯或制造商的规格设置图像采集参数。如果可用，请使用双向图像采集来减少扫描时间并提高效率。在软件中调整线平均，帧平均和帧累积。
通过识别开始和结束位置来设置Z堆栈，然后为青春期前卵巢选择两微米的Z步长，为青春期卵巢选择五微米的步长。接下来激活Z补偿功能和激励增益。通过为两者选择激光强度来设置样品底部和顶部的Z补偿。
对于无法在单个视场中捕获的较大样本，请使用切片模式。激活图像导航器，并使用矩形标记工具指示捕获整个样品所需的切片数量。设置完成后，从具有多个切片的图像的图像采集开始，使用导航器开始图像采集以捕获所有切片。
图像采集后，保存所有图像。如果获取了多个切片，请运行马赛克合并工具将切片合并到单个图像中。要确定卵母细胞的大小，请打开图像并选择切片选项以打开 Zs 堆栈图像。
选择线选项和测量面板，并通过从卵母细胞或标记物的一条边缘到最宽点的另一条边缘绘制一条线来确定卵母细胞的X Y直径来测量距离。在堆栈中移动并获得相同类型的多个卵母细胞的直径范围。使用最短长度作为卵母细胞计数的大小选择标准。
接下来，在 3D 视图选项中，选择点要素。在场景面板中，激活添加新点功能以打开算法面板。然后取消选择所有算法设置作为大小选择过滤器，并具有先前获得的卵母细胞大小。
单击通道前进箭头以移动到源通道。然后选择具有首选标记的通道，并在估计的 X、Y 直径中键入采集的直径。尺寸选择激活模型PSF伸长率和背景减法后，将自动确定。
然后，选择单个前进箭头以移动到滤光点面板，并添加质量滤镜以确定阈值。为了确保准确估计卵母细胞数量，放大图像。稍后，单击双箭头以完成自动计数。
使用编辑选项卡手动选择遗漏的卵母细胞或取消选择由自动阈值选择的非卵母细胞颗粒。完成后，将数据记录在整体选项卡下的统计信息选项卡中，以便进一步分析。为了估计总卵母细胞数量和受损卵巢，使用MRS打开完整卵巢的图像并选择框架特征。
在框架设置下，选择框网格勾选标记并访问标签。在位置XYZ选项卡中，选择200微米以在所有XYZ位置生成具有200微米空间的刻度线。使用200微米刻度线，选择落在每个卵巢体积的50%以内的卵母细胞。
单击斑点特征并选择编辑标签，按颜色对落在50%区域内的卵母细胞进行分类。在非灌注和灌注卵巢的代表性灰度多光子图像中，可以看到原始卵泡中的小卵母细胞具有薄层细胞质DDX4染色。此外，还发现了生长中的卵泡中较大的卵母细胞。
研究了产前和产后卵巢的多光子图像的3D渲染。在产后第28天，来自对照非辐照女性的卵巢在原始卵泡中含有大量小卵母细胞。相比之下，来自被照射女性的卵巢具有0.5灰度的伽马辐射，在原发卵泡中完全没有小卵母细胞。
但更大的卵母细胞仍然存在。为了定量卵母细胞，使用goucian滤光片在MRS软件中处理3D多光子图像，并使用斑点特征鉴定和定量小尺寸和大尺寸的卵母细胞。接下来，计算出各阶段卵母细胞的平均百分比与最早阶段存在的平均数量E相比，卵母细胞数量在E 15.5和E 18.5之间急剧下降，E 15.5和E 18.5胎儿卵母细胞表达第一行或第一P，如多光子图像所示。
强度分析显示，每卵母细胞一系或一P在E 18.5时的表达高于E 15.5。损伤小的卵巢可用于分析。使用计算校正确定总卵母细胞数量。
代表性模型显示E 15.5卵巢中的G CNA阳性卵母细胞，在完整的卵巢中突出显示了五个10%的区域。同样，产生了一个模拟卵巢，其中10%的增量区域缺失了高达50%的卵巢。将总卵母细胞数和模拟卵巢与原始完整卵巢进行比较。
并将差异表示为百分比偏差良好的灌注结果良好的图像质量。因此，在切换到PFA之前，请确保用PBS清除所有组织。通过修剪多余的组织，确保卵巢完全暴露。
该协议允许对大量样品进行有效分析，从遗传参考群体获得的定量数据如协作交叉或多样性输出将有助于识别卵母细胞发育的遗传修饰因子和卵母细胞数量。
