この方法は、生殖分野における重要な質問の1つ、すなわち、遺伝的に調節されたプロセスが卵巣予備の大きさにどのように影響するか、すなわち、女性、生殖寿命にどのように影響するかという重要な質問の1つに答えるのに役立ち得、このプロトコルは、異なる発達段階からの無傷の卵巣に対して同じ技術を使用する大規模な研究に採用することができる。生殖細胞の効率的な定量化を提供することによって生産可能なデータを生成します。同種の遺伝的に多様な動物に適用されるこの方法は、生殖細胞および卵巣の発生ならびに他の発達器官の遺伝的要因を直接的に知ることができる。
手順を実演するのは、私の研究室の研究インターンであるNathaniel Boechatです 豊富なステップの場所から始めて、麻酔をかけられた思春期の雌マウスを背中に固定し、足パッドを通してすべての脚をボードにリラックスした位置で優しく固定します。マウスの胸腔を開くには、肩甲骨のすぐ下の胸骨の両側の肋骨を慎重に切断し、肺の穿刺を避け、鉗子で皮膚または肋骨フラップをつかみ、フラップを固定して内臓を露出させ、解剖ハサミを使用して心臓の右心房を切り取り、システムから血液を放出する。次に、鉗子で心臓を保持することにより、左心室に灌流針を挿入し、穏やかで一定の圧力でPBSの10ミリリットルをポンプで送ります。
肝臓の腎臓や生殖管などの組織がピンク色から白色に変わったら、PBSを新しく作った1%パラホルムアルデヒドまたはPFAに置き換え、約10ミリリットルのPFAで灌流を続けます。次に、腎臓の下の卵巣を持つ脂肪パッドを見つけ、脂肪パッドの卵巣と子宮角を含む生殖管全体を静かに解剖して、4%PFAのバイアルに入れます。4%PFAを70%エタノールで置き換える前に、卵巣を室温で16〜24時間固定する。
染色の日に免疫染色を進める前に卵巣をトリミングする。免疫染色プロトコールの1日目に、1ウェル当たり1ミリリットルのPBSを清浄な24ウェルプレート中の所望の数のウェルにピペットする。1000マイクロリットルのピペットチップの先端を切り取って広い開口部を作り、広い先端を使用してバイアルから思春期卵巣を70%エタノールでウェルに穏やかに移し、ウェル内のPBSを新鮮な0.8ミリリットルのPBSで交換し、翌日ウェルからPBSを吸引し、ウェルあたり0.8ミリリットルの透過バッファーに置き換えます。
プレートを室温でシェーカー上で4時間インキュベートした後、3日目に透過緩衝液をブロッキング緩衝液に交換し、ブロッキング緩衝液で希釈することにより一次抗体を調製する。卵母細胞を視覚化するために、出生前および思春期前の卵巣を卵母細胞マーカーと共にインキュベートする。8日目にサンプルを新鮮な洗浄バッファーで2時間洗浄し、洗浄バッファーをブロッキングバッファーで希釈した0.5ミリリットルの二次抗体ミックスと交換します。
蒸発を防ぐためにプレートをパラフィルムでシールし、室温の暗所で3日間サンプルをインキュベートします。免疫染色洗浄後11日目に、洗浄バッファーを吸引し、0.8ミリリットルのスケール立方体1溶液と共にサンプルを37°Cで暗所で3日間インキュベートする。スケールを1次的に1つの溶液に毎日変更する。
15日目に、サンプルを室温で10分間および0.8ミリリットルのPBSで穏やかに振とうしながら3回洗浄する。次いで、PBSをPBSで調製したばかりの脱気20%スクロースの0.8ミリリットルと交換し、続いて室温で穏やかに振とうした。1時間後、20%スクロース溶液を交換して、前述のように、サンプルを0.8ミリリットルのスケール立方体2溶液で4〜5日間処理する。
セットアップされたサンプルを調製するには、先端がカットオフされた200マイクロリットルのピペットチップを使用して、15〜20マイクロリットルのスケール立方体2溶液で思春期卵巣を接着剤ウェルの中央に移す。卵巣が透明化溶液の滴で個々のウェルに移されたら、接着剤ウェルにカバーガラスを静かに置き、プレスして、サンプルと透明化溶液を2つのカバースリップの間に挟むシールを作成する。撮像場所については、3Dプリントされた顕微鏡アダプタスライドでカバースリップサンドイッチする。
顕微鏡コアまたは製造元の仕様に従って、画像取得用のパラメータを設定します。可能であれば、双方向画像取得を使用してスキャン時間を短縮し、効率を向上させます。ソフトウェアでライン平均、フレーム平均、フレーム累積を調整します。
開始位置と終了位置を特定してZスタックを設定し、思春期前卵巣の場合は2マイクロメートル、思春期卵巣の場合は5マイクロメートルのZステップサイズを選択します。次に、Z補正機能と励起ゲインを有効にします。サンプルの下部と上部の両方にレーザー強度を選択して、Z補正を設定します。
タイリングモードは、単一の視野でキャプチャできない大きなサンプルに使用します。画像ナビゲーターをアクティブにし、長方形のマーキング ツールを使用してサンプル全体をキャプチャするために必要なタイルの数を指定します。設定が完了したら、複数のタイルを持つ画像の画像取得から開始し、ナビゲータで画像取得を開始してすべてのタイルをキャプチャします。
画像取得後、すべての画像を保存します。また、複数のタイルが取得された場合は、モザイク結合ツールを実行してタイルを 1 つの画像にマージします。卵母細胞のサイズを決定するには、画像を開き、スライスオプションを選択してZsスタック画像を開きます。
[線]オプションと測定パネルを選択し、卵母細胞またはマーカーの一方のエッジから最も広い点で他方のエッジまで線を引いて距離を測定し、卵母細胞のX Y直径を決定します。スタック内を移動し、同じタイプの複数の卵母細胞の直径の範囲を取得します。卵母細胞数のサイズ選択基準として最短の長さを使用します。
次に、3D ビューオプションで、スポットフィーチャーを選択します。シーンパネルで、新しいスポットの追加機能を有効にして、アルゴリズムパネルを開きます。次に、先に取得した卵母細胞サイズを持つサイズ選択フィルタとしてすべてのアルゴリズム設定の選択を解除します。
チャンネルの順方向矢印をクリックして、ソースチャンネルに移動します。次に、優先マーカーを持つチャンネルを選択し、推定X、Y直径に取得した直径を入力します。サイズ選択後、自動的に決定されるモデルPSFの伸びとバックグラウンド減算をアクティブにします。
次に、単一の進む矢印を選択してフィルタースポットパネルに移動し、品質フィルターを追加してしきい値を決定します。卵母細胞数の正確な推定を確実にするために、画像を拡大する。後で、二重矢印をクリックして自動カウントを終了します。
[編集]タブを使用して、欠落した卵母細胞を手動で選択するか、自動しきい値で選択した非卵母細胞粒子の選択を解除します。完了したら、さらに分析するために、全体タブの下の [統計] タブにデータを記録します。総卵母細胞数および損傷した卵巣を推定するには、MRSで無傷の卵巣の画像を開き、フレーム特徴を選択する。
フレーム設定で、ボックスグリッドのチェックボックスとアクセスラベルを選択します。「XYZ」位置タブで「200 マイクロム」を選択して、すべての XYZ 位置に 200 マイクロメートルのスペースを持つ目盛りを生成します。200マイクロメートルの目盛りを使用して、各卵巣の体積の50%以内に収まる卵母細胞を選択します。
斑点特徴をクリックし、編集ラベルを選択して、50%領域内にある卵母細胞を色で分類します。代表的なグレースケールでは、非灌流および灌流卵巣の多光子画像において、細胞質DDX4染色の薄層を有する原始卵胞中の小さな卵母細胞が見られた。さらに、成長している卵胞内のより大きな卵母細胞が発見された。
出生前卵巣と出生後の卵巣の多光子画像からの3Dレンダリングが研究された。生後28日目において、対照非照射雌由来の卵巣は、原始卵胞内に小さな卵母細胞の大きな集団を含んでいた。対照的に、0.5グレイのガンマ線を照射された雌からの卵巣は、初代卵胞に小さな卵母細胞を完全に欠いていた。
しかし、より大きな卵母細胞はまだ存在していた。卵母細胞の定量化のために、3Dマルチフォトン画像をグーシアンフィルターを使用してMRSソフトウェアで処理し、スポット特徴を使用して大小サイズの卵母細胞を同定および定量化した。次に、卵母細胞の平均百分率を、E15.5とE18.5の間で急激に減少した最初期ステージに存在する平均数と比較して各ステージで算出したE15.5およびE18.5胎児卵母細胞は、多光子画像に見られるようにライン1または1Pを発現した。
強度分析では、E15.5よりもE18.5における卵母細胞当たりのライン1またはf1Pのより高い発現を示した。損傷の少ない卵巣を解析に使用することができます。総卵母細胞数は、計算補正を用いて決定される。
代表的なモデルは、E 15.5卵巣におけるG CNA陽性卵母細胞を示し、5つの10%領域が無傷の卵巣において強調表示されている。同様に、卵巣の50%まで欠落している10%増分領域を有するシミュレートされた卵巣が生成された。総卵母細胞数およびシミュレートされた卵巣を、元の無傷の卵巣と比較した。
そしてその差は、良好な灌流が良好な画質をもたらす偏差パーセントとして提示した。したがって、PFAに切り替える前に、すべての組織がPBSでクリアされていることを確認してください。余分な組織をトリミングして卵巣が完全に露出していることを確認してください。
このプロトコルは、多数のサンプルの効率的な分析を可能にし、協調交配または多様性出力などの遺伝的参照集団から得られた定量データは、卵母細胞発生および卵母細胞数の遺伝子修飾因子の同定に役立つであろう。
