该协议很重要，因为它易于执行并且任何实验室都可以使用。该协议允许从人或小鼠样品中分离HLA或MHC I型或II型肽。这种方法可以解决与涉及免疫系统的所有研究领域相关的科学问题，无论是癌症，病毒学还是自身免疫性疾病。
该协议旨在让在研究实验室工作的任何人都可以访问。只需按照步骤操作即可。通过称量每个样品80毫克并将其转移到15毫升锥形管中，开始激活Sepharose氰化物溴化物珠子。
加入五毫升一毫摩尔盐酸。上下移液五次，以方便重悬干燥的珠子，然后用额外的8.5毫升一毫摩尔盐酸填充锥形管。使用旋转器装置在室温下以20 RPM旋转珠子30分钟。
在室温下以200x G离心珠子两分钟，然后通过抽吸除去上清液。将500微升偶联缓冲液加入珠子调色板中，然后将珠悬浮液转移到新的两毫升离心管中并将其放在一边。为了将抗体偶联到这些微珠上，在新的两毫升微量离心管中加入两毫克选定的抗体，并用偶联缓冲溶液将体积增加到一毫升，以获得每毫升两毫克的最终浓度。
转移先前制备的微球溶液并将其添加到抗体溶液中。然后，使用旋转器装置以20RPM旋转微量离心管120分钟，离心珠子，然后如前所述除去上清液。现在，通过首先向含有抗体偶联微球的微量离心管中加入一毫升0.2摩尔甘氨酸，并在室温下使用旋转器装置以20RPM旋转60分钟，开始阻塞和洗涤微珠。
离心除去上清液后，用1毫升PBS洗涤珠子，离心除去上清液，并将珠子储存在1毫升PBS中，温度为4摄氏度直至使用。为了分离MHC I类或II类肽，通过用手掌加热管底部来解冻1亿个细胞的冷冻调色板。将500微升PBS加入调色板中，上下移液，直到悬浮液均匀。
将悬浮液转移到新的两毫升微量离心管中，并加入等体积的细胞裂解缓冲液。使用旋转器装置以 10 RPM 在 4 摄氏度下旋转 60 分钟。在4摄氏度下以18， 000x G离心细胞裂解物20分钟，并完全制动，并将上清液转移到新的两毫升微量离心管中。
通过离心并除去上清液来回收抗体偶联的微球。然后，将细胞裂解物上清液转移到抗体偶联的珠子中，并使用旋转器装置在4摄氏度下以10RPM孵育14至18小时过夜。第二天，取下聚丙烯柱的底盖，将柱子放在聚丙烯柱架上，并在下方安装一个空容器以收集流出物。
现在用10毫升缓冲液A冲洗聚丙烯柱，并通过重力排出。如果液体洗脱的流速太慢，进一步切割聚丙烯柱的底端。测量并收集珠子/裂解物混合物，并将其转移到聚丙烯柱中。
让液体混合物通过重力洗脱。或者，收集并冷冻20微升等分试样用于蛋白质印迹。现在，通过加入10毫升缓冲液A并使其通过重力洗脱来洗涤保留在聚丙烯柱中的珠子。
从机架上取下聚丙烯色谱柱，并将其放在新的两毫升微量离心管的顶部，用手将色谱柱和离心管固定在一起。向聚丙烯柱中加入300微升1%TFA，并通过上下管道五次混合珠子。然后，将洗脱液转移到新的两毫升微量离心管中。
为了脱盐和洗脱MHC肽，在C-18柱顶部加入200微升甲醇，并以1， 546x G离心三分钟以丢弃流出物。在C-18柱的顶部加入200微升80%乙腈在0.1%TFA中，再次离心以丢弃流出物。然后，加入200微升0.1%TFA，离心丢弃流出物。
最后，在C-18柱顶部加载200微升MHC肽复合物，通过离心丢弃流经，并重复直到加载完整体积。接下来，加入200微升0.1%TFA，离心丢弃流经物，将C-18柱转移到新的两毫升微量离心管中，并通过在0.1%TFA中加入150微升28%乙腈来洗脱MHC肽。离心后，将流出物收集在新的1.5毫升微量离心管中。
重复洗脱过程两次，总体积为450微升，并在零下20摄氏度下冷冻，直到用LC-MS-MS分析。使用这些纯化的肽在质谱仪中鉴定MHC I类和II类肽。与偶联前的抗体相比，当微珠与CNBr微球共价结合时，轻链和重链的信号染色强度显着降低，从而说明了微球的结合效率。
酸性洗脱后MHC肽复合物的分离通过抗HAL-ABC重链抗体对MHC肽复合物的强检测信号得到证实。还估计了使用当前方案的结果的个体内和个体间可重复性。在三个不同的生物重复中检测到的肽数量的平均变异系数很小，从1.9%到11%不等，然而，肽的身份差异很大，并且在三个生物重复中可重复检测到的肽的比例范围从39%到63%产生的热图显示了所鉴定肽的预测MHC结合强度。
对于小鼠MHC I类和II类肽，预测的强或弱结合剂分别为89%和87%。对于人HLA I类和II类肽，预测的强或弱结合剂分别为97%和70%。还生成了小鼠与人类用于LHC I类和II类肽的肽结合基序。
在该方案优化之前，小鼠MHC I类和II类肽的分离相当困难。这种优化的方案将有助于从体内小鼠模型中分离小鼠MHC I类和II类肽，例如，通常用于验证许多不同的疾病相关研究。
