线粒体严重依赖核基因组，尽管它们有自己的DNA。因此，需要一个高度管制的进口机制。这种方法有助于研究该过程以及它如何适应外部刺激。
这是唯一可用于定量评估蛋白质导入线粒体各个亚区室的生化技术。线粒体的生存能力与各种疾病状态有关，因此了解蛋白质进口如何被调节可能有助于靶向线粒体的新治疗方法。在隔离期间需要格外小心，以确保线粒体的活力和完整性。
彻底切碎组织并轻轻地重复所有后续颗粒是必要的。演示该程序的将是Ashley Oliveira，我实验室的博士生。要开始将线粒体从骨骼肌中分离出来，请从肌肉中除去脂肪和结缔组织，并在预冷的手表玻璃上切碎组织，直到它成为均匀的浆液。
将切碎的组织放入预冷的50毫升塑料离心管中，并记录确切的重量。然后，用含有ATP的缓冲液1将切碎的组织稀释十倍。使用八毫米双刀片均质机以9.8赫兹的功率输出对肌肉样品进行均质化10秒，确保没有可见的肌肉块残留。
在4摄氏度下以9， 000x G旋转样品10分钟后，将沉淀小心地重悬于约95微升的重悬培养基中。在丢弃上清液之前离心样品，并使用P-200移液管用大约180微升的重悬培养基轻轻重悬沉淀。对于体外翻译，准备足够的翻译反应混合物，为每个线粒体样品提供20微升，用于导入实验和翻译通道。
将反应物置于30摄氏度下孵育30分钟。翻译反应开始后15分钟，将90微克线粒体等分到无菌的1.5毫升管中，并在30摄氏度下预孵育10分钟。在一组新的无菌1.5毫升管中，将75微克线粒体与18微升的平移反应混合，并将管子在30摄氏度下孵育所需的时间。
将翻译反应的剩余体积保持在冰上。为了在适当的孵育时间后终止进口反应，从30摄氏度取出试管将其放在冰上，然后小心地将进口反应转移到带有蔗糖垫的管顶上。用蔗糖垫在17， 000x G下在4摄氏度下离心样品15分钟。
使用P-1000移液器，小心地除去上清液而不干扰沉淀。要导入外膜，使用Tom40进行反应，并将沉淀重悬于50微升新鲜制备的0.1摩尔碳酸钠中，并在冰上孵育30分钟。孵育后，将样品在4摄氏度下以14， 000x G离心五分钟。
接下来，按照手稿中所述为SDS-PAGE电泳准备样品。通过将剩余翻译反应的3微升与37微升裂解缓冲液和5微升样品染料混合，准备对照平移通道。将样品在95摄氏度下煮沸五分钟，然后以低速轻轻旋转，以避免线粒体成粒。
将样品涂敷到SDS聚丙烯酰胺凝胶中后，在通风橱中将凝胶在5%三氯乙酸或TCA中煮沸五分钟，并连续搅拌。然后，将凝胶置于双蒸馏水中，以每分钟50次旋转的速度旋转一分钟。将凝胶在旋转板上以每分钟50次旋转的速度在10毫摩尔Tris中洗涤5分钟。
为了沉淀蛋白质，用足够体积的单摩尔水杨酸洗涤凝胶，以将凝胶覆盖在旋转板上30分钟。要使凝胶脱水，请将一大张吸墨纸放在凝胶干燥机的多孔床上，并在将要应用凝胶的区域放置一张纸巾。然后，将11厘米×9厘米的吸墨纸切成11厘米，并将纸放在纸巾上。
使用第二张11厘米×9厘米的吸墨纸从容器中舀出凝胶，然后将凝胶平放在第一块的顶部。在凝胶上放一块稍大的塑料，确保包装下没有折痕或气泡。然后，将凝胶干燥器的塑料盖放在包装的顶部。
打开真空吸尘器。通过抬起塑料盖的一角并等待盖子重新密封，确保塑料盖已形成密封。关闭凝胶干燥器运行90分钟，从30摄氏度开始逐渐达到80摄氏度，并在运行结束时返回30摄氏度。
将凝胶包裹在干燥过程中使用的保鲜膜中。一旦脱水，凝胶会凝固并感觉像薄纸一样。将脱水凝胶置于顶部有磷膜的盒中。
在使用任何能够进行磷成像的合适成像仪使用放射自显像仪将凝胶可视化之前，先将胶片暴露24小时。代表性分析显示了苹果酸脱氢酶（MDH）在构肌下和肌原纤维间线粒体中的正常导入速率，以及前体MDH的翻译产物。加伐霉素抑制了MDH蛋白导入SS和IMF线粒体的基质。
类似地，洗涤剂Triton X由于内膜的增溶而抑制了MDH导入到两个亚组分中。对蛋白质进口的估计是在增加持续时间的情况下进行的，随后的数据表明，进口是一个时间依赖的过程，SS和IMF线粒体具有不同的进口率或能力。当大鼠受到电刺激时，与对照组相比，长期刺激动物导入外膜的Tom 40肌肉含量更高。
鸟氨酸转氨甲酰酶或OCT导入到线粒体基质中，在孵育的每个时间点都增加，导致长期刺激的肌肉的线粒体增加1.4倍。蛋白质导入与线粒体含量指数呈正相关，并通过COX活性进行评估。在研究线粒体介导的细胞凋亡时，Bax和Bak双敲除动物表现出减少蛋白质导入线粒体基质。
经过六周的自愿轮跑，挽救了双敲除动物的进口缺陷。重要的是要考虑变量，例如进口反应的持续时间以及要进口的蛋白质。细胞质级分可以掺入反应中，以了解胞质因子如何影响输入速率。
或者，可以在孵育前对蛋白质进行修饰，以了解蛋白质如何选择性地导入。这种技术可以帮助理解可能以各种疾病状态出现的线粒体肌病的复杂病因。
