荧光显微镜竞争滴定法测定转录机-dna 结合感的高灵敏度

为了增进对转录因子-DNA结合的理解，我们开发了一种使用各向异性测量大规模测量分离常数的方法。此技术允许自动获取全滴定曲线，以确定具有高灵敏度的分离常数。它在平衡下工作，具有适量的吞吐量和较大的动态范围。

我们应用HIP-FA来优化转录因子的结合亲和力。然而，该协议可以应用于其他类型的结合事件，如蛋白质-蛋白质或蛋白质-药物相互作用，例如。我建议首先与同一绑定伙伴执行多个滴定，以了解测量的可重复性。

如果可用，请使用自动化系统实现更好的可还原性。为了将参考DNA的DNA寡聚物退火，将每十毫摩尔二标记的七微升在一个管中，用无标签的反向链混合。对于竞争对手的 DNA，将每 100 毫摩尔未标记链中的 20 微升混合到 96 打井 PCR 板的两个孔中。

然后，使用标准 PCR 机器将 DNA 溶液加热到 70 摄氏度，为期三分钟。然后，以0.1摄氏度/秒的速度降至室温。使用微波炉在100毫升结合缓冲液中熔化0.5克阿加罗斯。

加入双蒸馏水以调节最终体积，以补偿可能的蒸发。准备十毫升股票等分。要准备 96 孔板的滴定和校准孔，请将两个凝胶库存等分转移到 75 摄氏度的培养箱摇床。

对于每滴定井，加入1.4纳米摩尔的参考DNA，转录因子蛋白，最终浓度为20-60纳米摩尔，0.2毫摩尔DTT，并结合缓冲液到240微升融化的凝胶。通过反转和摇动管子彻底混合。然后，在96孔板的指定滴定井中，缓慢移液200微升含DNA凝胶的含DNA凝胶。

对于每个校准井，添加5纳米摩尔尼罗蓝色染料到240微升融化的凝胶。避免气泡，缓慢移液器200微升的含有染料的凝胶溶液在5至6孔的96井板。将凝胶放在完全水平的表面上，在室温下孵育10分钟，在4摄氏度下再孵育10分钟。

使用多孔板读取器检查板不同孔中凝胶高度水平的均匀性。要准备竞争对手的DNA溶液，首先将标记的参考DNA、蛋白质和三倍浓缩结合缓冲液组合在一起。然后，将解决方案的 20 微升与每个退火竞争对手 DNA 解决方案的 40 微升混合。

对于每个校准井，结合适当数量的退火竞争对手DNA溶液和三倍浓缩结合缓冲液包含15毫摩尔尼罗蓝色染料溶液。最后，在凝胶上尽可能同时添加 50 微升的混合竞争对手解决方案。要开始图像采集，请将 96 井板放在显微镜舞台上。

然后，采取时间序列的Z堆栈图像的井，直到完全取消绑定的蛋白质从参考DNA。根据手稿进行滴定测定。然后使用 HIP-FA 软件为各个竞争对手序列创建滴定曲线。

然后，单击导出按钮，获得每个滴定井中活性蛋白的分离常数和浓度。在移液粘性凝胶溶液时，请特别小心。不准确的移液会降低确定分离常数的精度。

本研究采用HIP-FA方法确定B-压缩转录因子的DNA结合偏好。巨人，来自苍蝇分段基因网络。PWM 对于手动或使用自动化技术准备的复制具有高度相似性，这证明了 HiP-FA 方法的高可重复性。

通过这种方法获得的PWM和其他方法总体上是相似的。然而，在核心图案的第二位置和位置七可以看到显著偏差，其中突变可能导致完全失去结合，或者比之前的测量更牢固结合。我们使用HiP-FA对数十个转录因子的绑定进行优化，它表明最终获得了更好的数据预测。

我们相信，它的高精度测量可以非常有用，以更好地了解TF-DNA结合的所有系统或各种相互作用。