多发性骨髓瘤骨髓涂片的相间荧光 原位 杂交

将称为FISH的荧光原位杂交应用于多发性骨髓瘤的遗传风险分层至关重要。FISH报告的关键部分不是所有有核细胞，而是通过用抗CD138磁珠分选或用细胞质kappa或Lambda轻链免疫球蛋白标记称为cIg FISH的FISH测试特异性纯化或鉴定的克隆浆细胞。浆细胞分选或cIg FISH后的相间FISH在多发性骨髓瘤的诊断中具有显着意义，因为浆细胞在骨髓中的比例相对较低。

然而，这些方法存在一些缺点，包括工艺复杂，样品要求高和实验成本高。浆细胞可以快速定位在骨髓涂片中。基于此，我们使用骨髓涂片FISH来检测多发性骨髓瘤细胞。

本研究根据《赫尔辛基宣言》的原则进行，并经武汉大学中南医院伦理委员会批准。标本采集自中国武汉大学中南医院血液科的一名多发性骨髓瘤患者。将前0.2毫升骨髓溶液放在干净的一次性载玻片上，通过快速取出骨髓然后将其自然干燥，将骨髓涂片铺成均匀的厚度和锋利的尾巴。

在室温下用一毫升Wright-Giemsa溶液覆盖骨髓膜约10秒。向载玻片中加入一毫升磷酸盐缓冲液，需要小心防止染料溶液干燥或从载玻片中流出。轻轻混合染料溶液，并在室温下保持15分钟。

用清水冲洗载玻片，并在室温下在空气中干燥。使用正向光显微镜检测恶性浆细胞，浆细胞应分散良好。现在我们在现场看到的是相当分散的浆细胞。

这是一种典型的双核核浆细胞。用固定溶液覆盖杂交区域10分钟，以变色并固定浆细胞。用去离子水冲洗载玻片，并在室温下在空气中干燥。

在水浴中将含有两倍SSC缓冲液的罐子预热至56摄氏度。将制备的骨髓涂片在预热的两次SSC缓冲液中洗涤10分钟，然后在室温下浸入去离子水中。在乙醇梯度70%85%和100%乙醇中对涂片进行脱水一分钟。

将涂抹物在空气中干燥10分钟。首先将17号染色体探针混合物的着丝粒上的TP53添加到杂交区域，并用盖子覆盖，轻轻地按压细尖镊子以除去下面的气泡。用橡胶水泥密封盖玻片的所有侧面，以确保良好的密封性。

在橡胶水泥凝固后，将载玻片置于自动FISH机上，在78摄氏度下进行变性五分钟，然后在37摄氏度下杂交过夜。从鱼机上拿起幻灯片。使用细尖镊子轻轻去除橡胶水泥。

将载玻片浸入室温下两次SSC中约一到两分钟，以洗掉盖玻片。在水浴中以68摄氏度的预热缓冲液洗涤载玻片两分钟。在37摄氏度的水浴中用两次SSC洗涤载玻片一分钟。

在黑暗中设置，在10微升DAPI下彻底干燥10分钟到杂交区域，盖上盖子。使用荧光显微镜上设置的合适滤光片查看杂交载玻片，使用单色蓝色荧光团滤光片观察细胞核的荧光强度。在DAPI过滤器集下拍摄细胞核图像。

CEP17用绿色荧光标记。使用光谱绿色荧光团滤光片观察CEP17的位置。在绿色滤光片集下拍摄CEP17信号图像。

TP53基因用橙色荧光标记。使用光谱橙色荧光团滤光片观察TP53，在集合下拍摄TP53信号图像，将这三幅图像合并为一个整体，并检查数值异常。在正常的相间细胞中，在具有蓝色荧光的细胞核内观察到两个橙色和两个绿色信号，表明一对正常的染色体17。

结果显示了多发性骨髓瘤患者骨髓的形态和遗传学。图A显示，骨髓涂片中15%的浆细胞被发现具有比正常更大，更暗和核以及大量的细胞质。图B显示了由骨髓涂片中有核浆细胞代表的灰度图像。

图C显示浆细胞一个相间细胞核中的四个橙色和四个绿色信号，表明17号染色体的四个拷贝定位于一个细胞核中。图D显示，该患者的异常染色体核电图证实一个细胞核中有两对17号染色体。骨髓涂片比抗凝剂骨髓标本更容易获得，因为获得抗凝骨髓需要复杂的程序来获得细胞核。

因此，我们建立了一种令人信服的骨髓涂片FISH方法，用于检测多发性骨髓瘤细胞。