A aplicação da Fluorescência In Situ Hibridização chamada FISH à estratificação de risco genético em mieloma múltiplo é essencial. A parte crítica dos relatórios fish não são todas as células nucleadas, mas as células plasmáticas clonais especificamente purificadas ou identificadas por triagem com contas magnéticas anti-CD138 ou marcação com kappa citoplasmica ou imunoglobulina da cadeia de luz Lambda com teste de PEIXE chamado cIg FISH. Peixe interfáltico após a triagem de células plasmáticas ou cIg FISH acaba por ser significativo no diagnóstico de mieloma múltiplo, devido à proporção relativamente menor de células plasmáticas na medula óssea.
No entanto, esses métodos têm algumas deficiências, incluindo processos complexos, altas demandas de espécimes e altos custos experimentais. As células plasmáticas podem ser rapidamente localizadas em uma mancha de medula óssea. Com base nisso, usamos peixes de difamação de medula óssea para a detecção de múltiplas células de mieloma.
Este estudo foi conduzido de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan. Os espécimes foram coletados de um paciente de mieloma múltiplo no Departamento de Hematologia do Hospital Zhongnan da Universidade de Wuhan, na China. Coloque os primeiros 0,2 mililitros de solução de medula óssea em um deslizamento de vidro descartável limpo, espalhe as manchas de medula óssea para espessura uniforme e caudas afiadas, removendo rapidamente a medula óssea e depois seque-a naturalmente.
Cubra os filmes de medula óssea com um mililitro da solução Wright-Giemsa por aproximadamente 10 segundos em temperatura ambiente. Adicione um mililitro de tampão fosfato aos slides, foi necessário cuidado para evitar que a solução de corante secasse ou fluísse dos slides. Misture a solução de corante suavemente e mantenha-a por 15 minutos em temperatura ambiente.
Enxágüe os slides com água limpa e seque-a no ar à temperatura ambiente. Use microscopia de luz para a frente para detectar células plasmáticas malignas, as células plasmáticas devem estar bem dispersas. Agora o que vemos no campo são as células plasmáticas que estão bastante dispersas.
Esta é uma típica célula de plasma nuclear binuclear. Cubra a área hibridizada com solução fixativa por 10 minutos para descolorir e fixar células plasmáticas. Enxágüe o escorregador com água desionizada e seque-a no ar à temperatura ambiente.
Pré-aqueça um frasco contendo duas vezes o tampão SSC a 56 graus Celsius em um banho de água. Lave a mancha de medula óssea preparada no tampão pré-aquecido duas vezes SSC por 10 minutos seguido de mergulho em água deionizada à temperatura ambiente. Desidratar a mancha em um gradiente de etanol 70%85% e 100% etanol cada um por um minuto.
Seque a mancha no ar por 10 minutos. Primeiro adicione TP53 no centromere da mistura de sonda cromossomo 17 à área de hibridização e cubra-a com um deslizamento de tampa pressione suavemente as pinças pontiagudas finas para remover bolhas de ar por baixo. Sele todos os lados da tampa com cimento de borracha para garantir um bom aperto.
Após a solidificação do cimento de borracha, o slide foi colocado em uma máquina de peixe automática a desnaturação foi realizada a 78 graus Celsius por cinco minutos seguido de hibridização a 37 graus Celsius durante a noite. Pegue o slide da máquina FISH. Use uma pinça pontiaguda fina para remover o cimento de borracha suavemente.
Mergulhe o slide em duas vezes O SSC à temperatura ambiente por aproximadamente um ou dois minutos para lavar a tampa. Lave o slide em 68 graus Celsius antes do dia-a-dia em um banho de água por dois minutos. Lave os slides com duas vezes SSC em um banho de água de 37 graus Celsius por um minuto.
Coloque-o bem no escuro para secar completamente por 10 minutos a 10 microliter de DAPI até a área hibridizada, cubra com um deslizamento de cobertura. Veja o slide hibridizado usando um conjunto de filtro adequado em um microscópio de fluorescência, use filtro óptico fluorophore azul monocromático para observar a intensidade da fluorescência do núcleo celular. Tire imagens do núcleo celular sob um conjunto de filtro DAPI.
O CEP17 foi rotulado com fluorescência verde. Use filtro óptico fluoróforo verde de espectro para observar a localização do CEP17. Pegue a imagem de sinais CEP17 em conjunto de filtro verde.
O gene TP53 foi rotulado com fluorescência laranja. Use filtro óptico fluoróforo laranja de espectro para observar TP53, pegue sinais TP53 sob o conjunto, mescle essas três imagens em uma totalidade e examine para anormalidades numéricas. Em uma célula interfásico normal, dois sinais laranja e dois verdes são observados dentro de um núcleo com fluorescência azul indicando um par de cromossomos normais 17.
Os resultados mostraram a morfologia e genética da medula óssea em um paciente com mieloma múltiplo. A Figura A mostrou que 15% das células plasmáticas em uma mancha de medula óssea foram encontradas com maiores e mais escuras e nucleares, juntamente com grandes quantidades de citoplasma do que o normal. A figura B mostrou uma imagem em escala cinza de representação por uma célula plasmática nucleada em uma mancha de medula óssea.
A Figura C mostrou quatro sinais laranja e quatro verdes em um núcleo interfásico de células plasmáticas sugerindo que quatro cópias do cromossomo 17 foram localizadas em um núcleo. A Figura D mostrou que o karyograma de cromossomo anormal deste paciente confirmou dois pares de cromossomos 17 em um núcleo. As manchas de medula óssea são muito mais fáceis de obter do que as amostras de medula óssea anticoagulantes porque a obtenção de medula óssea anticoagulada requer procedimentos complexos para obter o núcleo.
Assim, estabelecemos um método convincente para a detecção de múltiplas células de mieloma.
