一种用于测量细胞手性的微图案化检测

微图案化底细胞手性测定是研究疾病发展中多细胞手性形态发生的有力工具。它对细胞研究也很重要。该宏观模式系统易于制造和使用，能够产生高度可靠和可重复的结果，并且还与大样本量的自动化高通量处理兼容。

首先将钛金涂层载玻片切割成约12×12毫米的小方块。使用玻璃切割机，在表面上滑动以留下凹痕状轨道，然后在两侧握住载玻片并在凹痕处弯曲以分成小区域。要清洁载玻片，请将其与黄金面一起浸泡在轨道振荡器上的培养皿中所含的100%乙醇中至少10分钟。

吸出乙醇后，用氮气流吹干载玻片。在用氮气干燥印章之前，用肥皂水清洁聚二甲基硅氧烷或PDMS印章。将5.74毫克十八烷硫醇或C18溶于10毫升100%乙醇中，制成两毫摩尔C18溶液，然后用100%乙醇清洗PDMS印章。

将图案表面朝下的PDMS印章浸泡在C18溶液中10秒钟，然后用氮气轻轻干燥60秒。干燥后，将印章面朝下放在金质载玻片上60秒钟，然后取出。为确保正确冲压，请轻轻地将镊子轻拍到印章上，以正确转移图案。

接下来，通过将一毫升70%乙醇移液到倒置的培养皿盖中来制备湿度室。使用镊子，铺上一块石蜡膜覆盖表面，确保没有气泡残留。如果需要，请除去多余的乙醇。

在湿度室的parafilm中，每四分之一载载玻片添加40微升EG3溶液，在液滴之间留出足够的空间来考虑金载玻片的间距。使用镊子将 C18 打印的金色载玻片面朝下放在液滴上，确保载玻片下方没有气泡。轻轻地将载玻片推在一起，不要提起它们，以尽量减少蒸发。

用薄膜密封培养皿后，将其置于室温下至少三个小时。在生物安全柜中，在70%乙醇中浸泡并冲洗金载玻片正面朝上三次以除去EG3，然后在乙醇中放置10分钟进行灭菌。吸出乙醇后，加入无菌PBS。

如图所示，用PBS代替乙醇制备另一个湿度室。接下来，每四分之一加入50微升的纤连蛋白溶液滴到parafil上，在液滴之间留出一些空间。然后如前所述，将载玻片面朝下放在液滴上，并将培养皿放在生物安全柜中30分钟。

将镀金载玻片冲洗三次后，将载玻片正面朝上放在PBS中。在接种细胞之前，在温度为37摄氏度的水浴中加热培养基和胰蛋白酶。为了更好地附着细胞，将图案载玻片浸泡在含有培养基的12孔板中，并在培养箱中以37摄氏度加热。

一旦细胞被胰蛋白酶消化，用含有FBS的培养基中和细胞，以100倍G沉淀细胞三分钟，然后将细胞沉淀重悬于新鲜培养基中。计数细胞并稀释细胞悬浮液以达到每毫升200， 000个细胞的浓度。向每个含有一个金载玻片的孔中加入0.5毫升细胞悬浮液。

轻轻摇动平板几次以获得均匀的细胞接种，然后孵育15分钟以进行细胞附着。15分钟后，在显微镜下检查细胞附着物，如果需要，再孵育一段时间。一旦细胞附着，从每个孔中抽出含有未附着细胞的培养基，并加入一毫升新鲜培养基。

在培养箱中培养细胞24小时，并检查汇合度以确定手性是否已经形成。当达到所需的汇合度时，通过去除培养基来固定细胞。用PBS冲洗一次后，向载玻片中加入4%多聚甲醛溶液，室温孵育15分钟，然后用PBS再次冲洗三次。

要获取图像，请使用具有相机功能的相差显微镜，并以高分辨率捕获载玻片上的每个环。对于手性表征，请下载 MATLAB 代码文件，将代码文件夹和子文件夹添加到 MATLAB 路径，然后打开ROI_selection。m 文件。

在第四行中，将目录更改为所需的数据文件夹。更改第 14 行中的图像大小，前两个数字表示戒指的内圆大小，而其他两个数字表示外圈大小。要确定相差图像中的感兴趣区域或 ROI，请执行 MATLAB 代码ROI_selection。

m，单击运行按钮。手动拖动选择方块以适合戒指，然后双击图像以确认选择。从文件夹中的所有图像中选择ROI后，将生成一个mat文件来存储每个图像的ROI信息。

然后打开analysis_batch。m 文件，然后更改文件夹的目录，如前所述。单击“运行”按钮以执行代码analysis_batch。

m用于确定多个细胞环模式的手性。一个数据到excel。将生成txt文件，其中包含每个环的圆形统计信息，以及顺时针非手性和逆时针环的数量。

目前的发现证明了开发的环模式手性测定在实验上的效用以及该测定对细胞骨架变化的敏感性。在本研究中发现，通过用50纳摩尔latrunculin A处理破坏肌动蛋白聚合，小鼠成肌细胞C2C12细胞表现出逆时针或CCW手性偏倚的改变，顺时针或 CW.In 添加，用12-o-十四烷基-佛bol-13-乙酸酯或TPA处理的人脐血管内皮细胞或hUVEC以激活蛋白激酶C表现出细胞手性从CW到CCW的剂量依赖性转移。在细胞接种到模式后，可以将化学物质或药物补充到培养基中以研究反应，并且可以结合transwell系统来研究细胞共培养。

该测定为研究不同实验环境下的多细胞手性提供了一种有效的工具，为细胞手性在各种生物现象和过程中的作用提供了重要的见解。