CD光谱学研究DNA-蛋白质相互作用

该协议使我们能够可视化由ATP依赖性染色质重塑蛋白诱导的DNA第二次重组的变化。DNA结构的变化可能与转录调控相关。这是一种简单且高度敏感的技术，它使用非常少量的纯DNA来记录寡核苷酸的结构变化。

该方法可以深入了解由ATP依赖性染色质重塑蛋白介导的转录调控。首先，新鲜制备缓冲液和其他反应组分的工作浓度，并在设置反应之前将它们保持在四摄氏度，然后使用NADH偶联氧化测定法在不同DNA分子存在下测量蛋白质的ATP酶活性。将0.1毫摩尔ADAAD，2毫摩尔ATP，10纳摩尔DNA和1X REG缓冲液在96孔板中混合至最终体积为250微升。

接下来，在37摄氏度的培养箱中孵育反应30分钟，然后使用与酶标仪一起提供的软件测量NAD +的量。要测量340纳米处的吸光度，请单击NADH测定并将96孔板放在仪器中的板架上，然后单击读取板按钮以记录吸光度。在高透明度石英比色皿中收集CD光谱。

使用矩形或圆柱形比色皿。要清洁比色皿，请用水清洗几次，然后扫描比色皿中的水或缓冲液以检查其是否干净。对于反应，使用PAGE纯化的DNA寡核苷酸。

为了快速冷却，在加热块上将DNA在94摄氏度下加热三分钟，然后立即在冰上冷却。对于缓慢冷却，在将DNA加热到94摄氏度三分钟后，让它以每分钟一摄氏度的速度冷却到室温。为了记录基线光谱，在1.5毫升离心管中逐个设置总共五个对照反应。

在所有反应中将反应体积保持在300微升。为了记录CD光谱，在1.5毫升离心管中逐个设置总共五个实验反应。要记录扫描，请打开气体并打开CD光谱仪。

10到15分钟后，打开灯，打开水浴，并将支架温度设置为37摄氏度。接下来，打开CD光谱软件，将温度设置为37摄氏度，波长范围在180至300纳米，每个点的时间为0.5秒，扫描编号设置为5，然后单击pro数据查看器，制作一个新文件，并使用实验的详细信息和日期对其进行重命名。接下来，通过移液混合基线和实验反应，并小心地将反应混合物逐个转移到比色皿中，确保没有气泡。

如果进行时间过程实验，请在37摄氏度下孵育反应所需的时间，然后进行扫描。将EDTA加入含有DNA，ATP，镁和蛋白质的缓冲液中以阻止ATP水解。为了完全抑制ATP酶活性，增加EDTA浓度和孵育时间。

从软件中的相应反应中减去基线，并在CD光谱软件或数据绘图软件中平滑数据，然后绘制波长与平均残差椭圆度的图表并分析峰值。M-folds表明MYC DNA的两条链都可以形成茎环状结构。这里显示了包含G四链体GECE的正向和反向DNA序列的M折叠结构。

在ATP和ADAAD不存在和存在的情况下，快速冷却的GECE的CD光谱表明，ADAAD诱导了两个正峰，一个在258纳米处，另一个在210纳米处。EDTA的加入废除了这种构象变化。CD光谱现在有一个负210纳米的峰值和一个宽的正波段，峰值在230和250纳米。

QGRS映射器和M折叠分析表明，DROSHA，DGCR8和DICER的启动子区域具有形成G四链体和茎状结构的潜力。DROSHA对5的CD光谱显示，ADAAD在210纳米处诱导负峰，在260纳米处诱导正峰。该光谱是ADNA的特征。

DGCR8对一的CD光谱在210纳米处显示正峰，在260纳米处显示宽负峰。该谱是B到X过渡的特征。对于DGCR8对7，在210纳米和270纳米处看到了强烈的正峰，在250纳米处看到了负峰。

该光谱是平行G四链体DNA结构的特征。最后，对于DICER对一，在210纳米处观察到一个正峰和两个负峰，一个在230纳米处，另一个在260纳米处。这些峰是A到X DNA过渡的特征。

确保DNA和蛋白质的纯度为99%以上。比色皿应干净，基线应小于一百分之一。所有试剂应为纯正，使背景小于一毫微。