DNA帘法破译组蛋白组装的分子机制

该协议显示了如何利用DNA帘技术研究染色质动力学，特别是研究组蛋白伴侣的分子功能。高通量单分子成像技术 DNA Curtain 克服了批量实验的局限性，促进了实时成像，从而能够详细表征生物分子相互作用。将尺寸为 5 x 35 毫米的干净纸放在双面胶带的中心。

将胶带贴在载玻片上，用纸覆盖两个孔和纳米图案。然后用干净的刀片切除纸张。将玻璃盖玻片放在双面胶带的顶部，然后用移液管吸头摩擦盖玻片以形成微流体腔。

将组装好的流通池放在两个显微镜载玻片之间，并夹住它们。将流通池在120摄氏度的真空烘箱中烘烤45分钟。使用热胶枪将用于基于芯片的分析的流体连接器连接到每个开孔。

并连接两条诱饵锁管线。连接装有三毫升去离子水的诱饵锁注射器，然后清洗腔室。通过逐滴连接，用三毫升脂质缓冲液再次清洗腔室。

将一毫升0.04x生物素化脂质在脂质缓冲液中注入腔室，分两次注射，每次孵育5分钟。在一毫升 BSA 中注射每毫升 0.025 毫克链霉亲和素，注射两次，每次注射孵育 10 分钟。将大约 30 皮摩尔的生物素化 lambda 噬菌体 DNA 注射到一毫升 BSA 缓冲液中，分两次注射进入腔室，每次注射孵育 10 分钟。

将含有 10 毫升成像缓冲液的注射器连接到注射泵，并去除微流控系统中所有管路中的气泡。通过滴对滴连接将制备的流通池与微流控系统耦合，以避免气泡注入流通池。组装流通池和流通池支架，并将组件安装在定制的全内反射荧光显微镜上。

通过 100 微升样品环在成像缓冲液中注入 200 微升 YOYO-1 染料以染色 Lambda DNA 分子。运行成像软件，打开488纳米激光器，检查DNA光幕是否形成良好。去除YOYO-1染料后，注入预孵育的蛋白质样品。

当蛋白质到达 DNA 幕时，关闭注射泵，关闭截止阀，孵育 15 分钟，以便 Abo1 加载组蛋白。洗出未结合的 Abo1 和组蛋白 5 分钟。瞬时关闭缓冲液流，以检查组蛋白是否加载到 DNA 上。

通过用插值染料对DNA分子进行染色来检查DNA幕的形成。平行阵列中显示的绿线表明，在流体动力流下，插入DNA分子的YOYO1在扩散势垒处排列和拉伸良好。当Cy5-H3-H4二聚体在没有Abo1的情况下注入DNA幕时，Cy5-H3-H4不与DNA结合，表明H3-H4二聚体与DNA缺乏自发结合。

当 Cy5-H3-H4 注射 Abo1 时，DNA 分子上出现红色荧光点，表明 Abo1 将 H3-H4 二聚体加载到 DNA 上。荧光信号在没有缓冲液流动的情况下消失，并在恢复流动时重新出现，表明 H3-H4 二聚体与 DNA 结合。H3-H4二聚体与DNA的结合也得到了kymograph的证实，其中每当流动关闭时，荧光信号就会消失。

在没有核苷酸或存在 ADP 的情况下，DNA 幕中出现很少的荧光点，这表明 H3-H4 二聚体很少与 DNA 结合，无论是在 Apo 状态下还是在 ADP 存在下。定量分析表明，在ATP存在下，与DNA结合的H3-H4二聚体数量增加。结果表明，ATP水解对于Abo1将H3-H4负载到DNA上是必不可少的。

避免将气泡注入流通池是所有步骤中最关键的步骤。因此，在此协议中，我们强调逐滴连接。DNA幕式分析可以扩展到具有双纳米模式的双系系DNA幕。

此外，我们可以用单链DNA、RNA或肌动蛋白丝制作另一种类型的DNA幕。DNA幕可以可视化蛋白质在DNA上的运动，并有助于研究靶标搜索机制。DNA帷幕可以扩展用于研究DNA代谢，包括复制和转录。