利用开源移液机器人的高效SARS-CoV-2定量逆转录酶PCR唾液诊断策略

我们开发了一种低成本、基于唾液的COVID 19诊断测试和工作流程，易于实施和扩展，适用于大规模社区筛查应用。在这里，我们使用开源液体处理机器人，标准热循环仪和软件来执行唾液的直接测试，而无需提取或稳定缓冲液，同时仍然提供准确的诊断结果。由于简单的自动化并行工作流程，该系统可以扩展，每天以最少的设备、空间和人员需求执行数千次测试。

除了Kylie King之外，我们的临床实验室主管Rachel Ham和我们的教育协调员Austin Smothers将帮助演示该过程，首先用70%乙醇对唾液收集管的外部进行消毒，并将其转移到实验室进行测试。通过将每个样品条形码扫描到每日摄入量电子表格中来记录样品到达情况。在95摄氏度的烤箱中对扫描样品进行30分钟的热处理，然后使用耐热手套取出样品。

在样品分配站打开每个样品装载机器人的每日样品装载电子表格。然后将188个样品分配给每个384孔板。为托盘贴上标签，并附上印版名称、日期和季度编号。

将样品按顺序扫描到样品加载电子表格中。在样品装载站，排列两套完整的八个3D打印架，对应于机器人中的甲板位置。拆开四分之一管并将它们放在3D打印的机架中，从第一个机架中的位置A1开始。

从左到右，从上到下填充每个机架。在 2 号机架中继续此装载模式，然后转到 4 号和 5 号机架。将装载的四分之一样品架放在甲板一，二，四，五，七，八，10，11上。

将 P20 吸头放在 3 号和 9 号甲板上。为了简化设置过程，将材料从后到前加载到机器人中。预混料板在专用机器人上生产，并在四摄氏度下储存。

一次使用一个板并标有板名，并使用锋利的刀片在控制井周围的箔片中切割一条线。将预混板放在甲板六上，剥开铝箔盖，留下覆盖控制井的小矩形。揭开吸头盒并关闭机器人。

通过机器人桌面应用程序单击“开始运行”来初始化自定义 Python 操作协议。每个季度需要24.5分钟才能装到盘子上。将计时器设置为提醒。

当机器人运行时，将两个样品管拆封并加载到第二组3D打印架中。当机器人暂停时，取下第一季度机架并将其替换为第二季度机架，然后在桌面应用程序中单击“恢复运行”。回顾第一季度样品管，并将其储存在四摄氏度的冰箱中，同时等待结果。

对第三季度和第四季度重复此加载过程。将装载的板转移到生物安全柜中。为尽量减少污染，请在转移过程中盖上板。

收集所有重复样本，并将其指定为第四季度的最后一个样本。对样品进行编号，扫描条形码，并将原始样品位置和结果输入样品加载电子表格。将重复样品转移到生物安全柜中。

不要将重复的样品管装载到机器人装载架中。将每个重复样品的两微升移液到正确的孔中。使用指定的移液器添加患者样本。

在添加样品时，保持对照孔覆盖铝箔，以尽量减少污染。使用镊子剥离控制孔上的铝箔盖。将两微升确诊的阳性患者样本移入M23和M24孔中。

将两微升无核酸酶水移入N23至N24井，并将每微升200份的两微升混合阳性对照移取至O23至O24井。将孔P23至P24留空，以监测预混料批次质量。用光学透明密封覆盖板，并使用涂药辊将密封粘附在所有孔上。

以2， 500 RPM涡旋板30秒以充分混合，然后将板以500倍G离心一分钟。在热循环仪软件中选择协议程序，并保存协议以供将来的板使用。将密封板放入热循环器中并运行协议。

导出 CT 值并将这些值复制到样品加载电子表格中。对于阳性对照，检查P1和N1探针的至少一个阳性对照井是否产生22至28之间的CT值。或者，已知的阳性样品孔在P1和N1探针上产生的P1和N1 CT值小于33。

对于阴性对照，检查两个阴性对照孔中的任何一个中没有N1或P1 CT值。在使板失效之前，确认CT值具有有效的扩增曲线。如果 P1 产生的 CT 结果小于 33，则认为该井有效，然后继续从 N1 获得结果。如果 P1 产生的结果 CT 大于或等于 33 或无 CT 值，则认为该井无效。

如果N1产生CT小于33的结果，则评估为是。如果 N1 未产生 CT 值，则将井评估为否。如果 N1 产生的 CT 值大于或等于 33，则将该井评估为无星。

确认所有N1 CT值都与实际扩增曲线相关联。如果 N1 的 CT 值没有扩增曲线，则该阱为 no。识别重复样品，使用内部样品编号和样品类型对其进行标记，然后将其返回到装载工作流程。

代表性图像显示了N1或SARS CoV-2合成RNA和P1或HSRPP30合成DNA的RTQ PCR检测。使用标准偏差绘制标准曲线，以确定使用该探针引物组合的精确检测范围。将各自稀释液中获得的平均CT值与合成RNA和合成DNA的估计数量进行对比。

在这两种情况下，线性曲线在广泛的基因复制浓度范围内显示出良好的相关系数。使用机器人和手动样品上样从独特样品中获得的N1 CT值被转置，以确定手动和机器人上样之间的测定间变异性。手动和自动方法之间的线性关系产生了高相关系数，表明两种方法在功能上是等效的。

使用从机器人和手动样品上样获得的转置复制N1 CT值测定内变异性。此处显示了用于降低唾液粘度的热处理方法的评估。从单一来源收集SARS CoV-2阴性唾液，并在95摄氏度下对等分试样进行0分钟，30分钟或60分钟的热处理。

绘制了每种病症的技术重复的P1 CT值，以确定治疗方法之间的变异性。与无处理对照相比，30分钟和60分钟的热处理方法产生的样品变异性显着降低。30分钟和60分钟的治疗之间没有显着差异。

因此，实施了30分钟的热处理方法，以减少处理时间。使用适当的无菌技术以尽量减少对测试板的污染，特别是在装载手动样品和对照时。避免用手或袖子越过盘子。

在产生临床结果后，可以将样品丢弃在生物危害废物中，也可以保存以进行进一步分析，例如全基因组测序以确定特定菌株。该技术允许进行大规模的社区测试，这使我们能够调查测试覆盖率的影响以及Covid 19的非症状传播。