该协议描述了属于振荡器的丝状蓝藻如何通过自然转化进行转化。它还展示了如何研究不同类型的运动。自然变换是最简单的变换技术，如果它有效的话。
只需要DNA，细胞和生长培养基。到目前为止，没有其他振荡器成员可以通过自然变换来转化。我们希望我们的研究能刺激其他小组尝试其他振荡器。
对于转化，要进行良好，健康的外观培养和良好的DNA制备。对于运动研究，始终使用超声处理培养物。治疗应新鲜。
演示该程序的将是来自我实验室的技术人员Nora Weber。首先将50毫升液体F2培养基接种到两个250毫升烧瓶中，每瓶来自运行培养物的一毫升P.lacuna细丝。在25摄氏度的激越下在白光下培养约五天。
五天后，以10， 000 RPM匀浆100毫升P.lacuna细胞悬浮液三分钟，并在750纳米处测量光密度。然后，以6， 000倍G离心细胞悬浮液15分钟，除去上清液并将沉淀悬浮在800微升剩余液体和额外的F2 +培养基中。取八个F2 + Bacto琼脂平板，每毫升含有120微克卡那霉素，并将10微克DNA移液到每个琼脂平板的中间。
立即移液100微升的细胞悬浮液在DNA的顶部。将琼脂板放在干净的工作台上，不要盖上盖子，以使多余的液体蒸发。关闭盘子，在25摄氏度的白光下培养两天。
两天后，将每个琼脂平板的细丝分配到几个新鲜的F2 + Bacto琼脂平板上，每毫升卡那霉素含有120微克，并带有接种环。在25摄氏度的白光下培养板，并在显微镜下定期检查培养物。14至28天后，识别死亡的褐色细丝，并在显微镜下寻找转化的细丝。
转化后的细丝看起来健康和绿色，与大部分细丝不同。将每个转化后的长丝转移到50毫升的烧瓶中，其中10毫升F2 +培养基，每毫升卡那霉素250微克。在25摄氏度的白光下摇床上培养，观察生长长达四周。
将细丝转移回含有每毫升卡那霉素250微克的琼脂培养基中，并等待细丝生长。然后，再次增加卡那霉素浓度以加速分离。对于GFP表达，用荧光显微镜以40X或63X放大倍率观察单丝，并捕获明场透射图像和荧光图像。
在50 RPM水平搅拌下在白光下在F2培养基中培养P.voida约五天，直到750纳米处的估计光密度变为0.35。将样品储存在四摄氏度。用超声波以最大功率和循环使细丝均质一分钟。
测量750纳米的光密度，并将含有P.lacuna的8毫升介质转移到六厘米的培养皿中。等待几分钟，直到样品达到室温，然后用玻璃纸箔覆盖培养皿。将显微镜载玻片放在带相机的标准显微镜的X-Y台上。
打开显微镜灯，将4X或10X物镜移动到光的路径中。然后，将培养皿放在幻灯片的顶部。通过工作台的 X、Y 和 Z 运动调整单细丝或灯丝束。
观察单丝或束的运动，并使用标准显微镜相机记录运动。确保物镜不接触液体。移液0.5毫升含有P.lacuna的溶液在六厘米培养皿的Bacto琼脂表面上。
让液体进入表面。大约20分钟后，关闭培养皿，并使用4X或10X物镜观察细丝在表面上的运动。使用目测摄像头和微型计算机系统捕捉延时记录。
细丝必须首先通过眼睛聚焦，然后通过眼部摄像头。确保后续图像之间的时间间隔为五秒到一分钟。对微型计算机的Linux脚本进行编程，以控制延时记录。
准备安装五毫米LED的LED支架，从下面到上方照射20毫米正方形的区域。测量和调整 LED 强度。确保整个设置位于黑暗的房间或封闭的黑暗容器中。
将八毫升含有P.lacuna的培养基放入六厘米的培养皿中，用盖子关闭培养皿，并将其放在LED支架上，以使LED位于培养皿的中心。通常在两天后，用智能手机摄像头直接瞄准光处理位置捕获培养皿的图像。使用支架和白色纸张作为背景，以确保每张照片的距离和光线条件相同。
打开ImageJ软件，单击“文件”，“打开”，然后选择文件。然后，单击 Enter。选择笔直按钮，然后按鼠标左键，从培养皿的一端到另一端画一条线。
确保线穿过细丝圆的中心。单击“分析和测量”以查看培养皿的长度。然后，单击“图像J”菜单中的“分析和绘制配置文件”。
估计圆圈外像素强度的平均值和圆圈内像素强度的另一个平均值。将鼠标指向这些值之间的 Y 位置，以估计圆两侧的 X 值。记下这两个值并计算差值。
然后选择直线按钮，并在像素强度的中间最大值处绘制一条线。最后，单击“分析”，然后单击“测量”以获取内细胞圆圈的长度。此处显示了P.lacuna与PAK1转化后插入物的整合和分离。
在转化后一周左右使用外部引物进行的PCR测试通常在电泳凝胶上有两条条带，一条具有野生型条带的大小，另一条较慢的迁移条带表明电阻盒的插入。此处，泳道 1 至 4 表示在分离耐药丝 7 天、11 天、14 天和 17 天后丝的 PCR 产物，泳道 5 表示野生型 PCR 产物。在七天的样品中，插入片段存在于染色体的一小部分中。
该分数增加至17天，其中没有野生型条带可见;也就是说，分离是完全的。该图像代表在内源性藻蓝蛋白β启动子控制下sfGHP表达的载体pMH1。此处显示了 P.lacuna 同源序列、pUC19 载体主链以及具有 sfGFP 和卡那霉素耐药性的插入片段。
在pMH1中，sfGHP基因被置于藻蓝蛋白β基因的三个素数中，因此由内源性cpcβ启动子驱动。此处显示了P.lacuna野生型细丝以及与PAK1，PAK2，PAK3和pMH1转化后的荧光图像。sfGFP的表达由cpc 560启动子，a2813启动子，psbA2S启动子或内源性cpcβ启动子驱动。
这里展示的合并图像显示了Phormidium lacuna的运动性。琼脂表面的运动如图所示。时间间隔为一分钟。
液体介质中的运动在这里介绍。时间间隔为 10 秒。自然变换是一种简单的方法。
只需将质粒DNA与具有同源序列的抗性盒与细胞混合，然后让细胞在含有抗生素的培养基上生长。基因可以被灭活，蛋白质可以被过度表达。这对于任何基础研究和生物技术研究都很重要。
在也建立了自然转化的单细胞蓝藻中，讨论了光合作用或光感受器等的分子研究。
