Este protocolo descreve como o cianobacterium filamentoso que pertence aos oscillatoriales pode ser transformado pela transformação natural. Também mostra como diferentes tipos de movimento podem ser estudados. A transformação natural é a técnica de transformação mais simples, se funcionar.
Apenas DNA, células e meio de crescimento são necessários. Até agora, nenhum outro membro oscillatorial poderia ser transformado pela transformação natural. Esperamos que nossos estudos estimulem outros grupos a tentar outras oscilações.
Para a transformação, faça uma boa e saudável cultura de aparência e uma boa preparação de DNA. Para estudos de movimento, use sempre uma cultura tratada com ultrassom. O tratamento deve ser fresco.
Demonstrando o procedimento estará Nora Weber, técnica do meu laboratório. Comece inoculando 50 mililitros líquidos F2 em cada um dos dois frascos de 250 mililitros com um mililitro de filamentos P.lacuna de uma cultura em execução. Cultive com luz branca sob agitação por cerca de cinco dias a 25 graus Celsius.
Após cinco dias, homogeneize 100 mililitros de suspensão celular P.lacuna a 10.000 RPM por três minutos e meça a densidade óptica em 750 nanômetros. Em seguida, centrifuse a suspensão celular por 15 minutos a 6.000 vezes G.Remova o supernascer e suspenda a pelota em 800 microliters do líquido restante e adicional F2+médio. Leve oito placas de ágar F2+Bacto contendo 120 microgramas por mililitro kanamycin e pipeta 10 microgramas de DNA no meio de cada placa de ágar.
Imediatamente pipeta 100 microliters da suspensão celular em cima do DNA. Mantenha a placa de ágar sem tampa no banco limpo para permitir que o excesso de líquido evapore. Feche a placa e cultive-a em luz branca a 25 graus Celsius por dois dias.
Após dois dias, distribua os filamentos de cada placa de ágar em várias placas frescas de ágar F2+Bacto contendo 120 microgramas por kanamicina mililitro com um laço de inoculação. Cultive as placas em luz branca a 25 graus Celsius e verifique as culturas regularmente sob um microscópio. Após 14 a 28 dias, identifique os filamentos acastúsis mortos e procure filamentos transformados sob o microscópio.
Os filamentos transformados parecem saudáveis e verdes e são diferentes da maior parte dos filamentos. Transfira cada filamento transformado em frascos de 50 mililitros com 10 mililitros de F2+médio com 250 microgramas por kanamicina mililitro. Cultive em luz branca a 25 graus Celsius em um agitador e observe o crescimento por até quatro semanas.
Transfira os filamentos de volta para o meio ágar contendo 250 microgramas por mililitro kanamycin e espere que os filamentos cresçam. Então, aumente a concentração de kanamicina novamente para acelerar a segregação. Para a expressão GFP, observa filamentos únicos com um microscópio de fluorescência a ampliação de 40X ou 63X e captura uma imagem de transmissão de campo brilhante e uma imagem de fluorescência.
Cultivar P.lacuna em f2 médio sob agitação horizontal de 50 RPM em luz branca por cerca de cinco dias até que a densidade óptica estimada em 750 nanômetros se torne 0,35. Armazene a amostra a 4 graus Celsius. Homogeneize os filamentos com ultrassom por um minuto na potência máxima e ciclo de um.
Meça a densidade óptica em 750 nanômetros e transfira oito mililitros do meio contendo P.lacuna em uma placa de Petri de seis centímetros. Aguarde alguns minutos até que a amostra atinja a temperatura ambiente e cubra a placa de Petri com papel alumínio. Coloque um slide de microscópio na tabela X-Y de um microscópio padrão com uma câmera.
Ligue a luz do microscópio e mova um objetivo 4X ou 10X para o caminho da luz. Em seguida, coloque a placa de Petri em cima do slide. Ajuste filamentos individuais ou pacotes de filamentos pelos movimentos X, Y e Z da tabela.
Observe os movimentos de filamentos ou feixes únicos e grave os movimentos com uma câmera de microscópio padrão. Certifique-se de que a lente objetiva não toque no líquido. Pipeta 0,5 mililitros de uma solução contendo P.lacuna na superfície do ágar Bacto de uma placa de Petri de seis centímetros.
Deixe o líquido entrar na superfície. Após cerca de 20 minutos, feche a placa de Petri e observe o movimento dos filamentos na superfície usando um objetivo 4X ou 10X. Capture as gravações de lapso de tempo usando uma câmera ocular e um sistema de minicomp que o computador.
Os filamentos devem primeiro ser focados pelos olhos e depois pela câmera ocular. Certifique-se de que o intervalo de tempo entre as imagens subsequentes é de cinco segundos a um minuto. Programe o script Linux do minicomp que o computador para controlar a gravação do lapso de tempo.
Prepare os suportes de LED onde os LEDs de cinco milímetros são montados para irradiar uma área de 20 milímetros quadrados de baixo para cima. Meça e ajuste as intensidades do LED. Certifique-se de que toda a configuração está em uma sala escura ou em um recipiente fechado e escuro.
Coloque oito mililitros do meio contendo P.lacuna em uma placa de Petri de seis centímetros, feche a placa de Petri com a tampa e coloque-a em um suporte de LED para que o LED esteja no centro da placa de Petri. Após tipicamente dois dias, capture uma imagem da placa de Petri com uma câmera de smartphone voltada diretamente para a posição do tratamento de luz. Use um suporte e uma folha branca como plano de fundo para garantir a mesma distância e condições de luz para cada imagem.
Abra o software ImageJ, clique em Arquivo, Abra e selecione o arquivo. Em seguida, clique em Enter. Selecione o botão reto e pressione o botão esquerdo do mouse para desenhar uma linha de uma extremidade da placa de Petri até a extremidade oposta.
Certifique-se de que a linha passe pelo centro do círculo de filamentos. Clique em Analisar e Medir para ver o comprimento da placa de Petri. Em seguida, clique em Analisar e Traçar perfil no menu ImageJ.
Estime um valor médio para a intensidade do pixel fora do círculo e outro valor médio para a intensidade do pixel dentro do círculo. Aponte o mouse sobre a posição Y entre esses valores para estimar os valores X de ambos os lados do círculo. Observe ambos os valores e calcule a diferença.
Em seguida, selecione o botão reto e desenhe uma linha no valor médio-máximo da intensidade do pixel. Por fim, clique em Analisar e, em seguida, Meça para obter o comprimento do círculo da célula interna. A integração e a segregação da inserção após a transformação de P.lacuna com PAK1 é mostrada aqui.
Um teste pcr com primers externos cerca de uma semana após a transformação normalmente tem duas bandas no gel de eletroforese, uma com o tamanho da banda tipo selvagem, e uma banda migratória mais lenta que indica a inserção do de resistência. Aqui, as faixas 1 a 4 representam produtos PCR de filamentos após sete dias, 11 dias, 14 dias e 17 dias de isolamento de um filamento resistente, e a pista 5 representa produto PCR do tipo selvagem. Na amostra de sete dias, a inserção está presente em uma pequena fração dos cromossomos.
Esta fração aumenta até 17 dias, onde nenhuma banda do tipo selvagem é visível;ou seja, a segregação está completa. Esta imagem representa o vetor pMH1 para expressão sfGHP sob o controle do promotor beta de ficocyanina endógena. P.lacuna sequência homólogo, espinha dorsal vetorial pUC19 e inserção com resistência sfGFP e kanamycin são mostrados aqui.
No pMH1, o gene sfGHP é colocado três primos do gene beta de ficocyanina;portanto, é impulsionado pelo promotor beta do cpc endógeno. Imagens de fluorescência de filamentos do tipo selvagem P.lacuna e após a transformação com PAK1, PAK2, PAK3 e pMH1 são mostradas aqui. A expressão do SFGFP é impulsionada pelo promotor do CPC 560, pelo promotor a2813, pelo promotor do PSBA2S ou pelo promotor beta endógeno do CPC.
As imagens mescladas aqui apresentadas mostram a motilidade da lacuna phormidium. O movimento na superfície do ágar é mostrado aqui. O intervalo de tempo foi de um minuto.
O movimento no meio líquido é apresentado aqui. O intervalo de tempo foi de 10 segundos. Transformação natural é um método simples.
Basta misturar DNA plasmídeo com uma fita de resistência em sequências homólogos com as células e deixar as células crescerem em um meio com antibióticos. Genes podem ser inativados e proteínas podem ser superexpressas. Isso é importante para qualquer pesquisa básica e para estudos biotécnicos.
Em cianobactérias unicelulares onde a transformação natural também é estabelecida, foram abordados estudos moleculares sobre fotossíntese ou fotorreceptores, etc.
