Questo protocollo descrive come il cianobatterio filamentoso che appartiene agli oscillatoriali può essere trasformato dalla trasformazione naturale. Mostra anche come possono essere studiati diversi tipi di movimento. La trasformazione naturale è la tecnica di trasformazione più semplice, se funziona.
Sono necessari solo DNA, cellule e mezzo di crescita. Finora, nessun altro membro oscillatoriales potrebbe essere trasformato dalla trasformazione naturale. Speriamo che i nostri studi stimolino altri gruppi a provare altre oscillazioni.
Per la trasformazione, crea una cultura dall'aspetto buono e sano e una buona preparazione del DNA. Per gli studi sul movimento, utilizzare sempre una coltura trattata con ultrasuoni. Il trattamento dovrebbe essere fresco.
A dimostrare la procedura sarà Nora Weber, un tecnico del mio laboratorio. Inizia inoculando 50 millilitri di mezzo liquido F2 in ciascuno dei due palloni da 250 millilitri con un millilitro di filamenti P.lacuna da una coltura in esecuzione. Coltivare in luce bianca sotto agitazione per circa cinque giorni a 25 gradi Celsius.
Dopo cinque giorni, omogeneizzare 100 millilitri di sospensione cellulare P.lacuna a 10.000 RPM per tre minuti e misurare la densità ottica a 750 nanometri. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare per 15 minuti a 6.000 volte G.Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet in 800 microlitri del liquido rimanente e del mezzo F2 + aggiuntivo. Prendi otto piastre di agar F2 + Bacto contenenti 120 microgrammi per millilitro kanamicina e pipetta 10 microgrammi di DNA nel mezzo di ogni piastra di agar.
Immediatamente pipettare 100 microlitri della sospensione cellulare sulla parte superiore del DNA. Tenere la piastra di agar senza coperchio sul banco pulito per consentire al liquido in eccesso di evaporare. Chiudere il piatto e coltivarlo in luce bianca a 25 gradi Celsius per due giorni.
Dopo due giorni, distribuire i filamenti di ciascuna piastra di agar su diverse piastre di agar F2+Bacto fresche contenenti 120 microgrammi per millilitro kanamicina con un ciclo di inoculazione. Coltivare le piastre in luce bianca a 25 gradi Celsius e controllare regolarmente le colture al microscopio. Dopo 14-28 giorni, identifica i filamenti brunastri morti e cerca i filamenti trasformati al microscopio.
I filamenti trasformati sembrano sani e verdi e sono diversi dalla maggior parte dei filamenti. Trasferire ogni singolo filamento trasformato in palloni da 50 millilitri con 10 millilitri di F2+medium con 250 microgrammi per millilitro kanamicina. Coltiva in luce bianca a 25 gradi Celsius su uno shaker e osserva la crescita per un massimo di quattro settimane.
Trasferire i filamenti sul mezzo agar contenente 250 microgrammi per millilitro kanamicina e attendere che i filamenti crescano. Quindi, aumentare nuovamente la concentrazione di kanamicina per accelerare la segregazione. Per l'espressione GFP, osserva singoli filamenti con un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 40X o 63X e cattura un'immagine di trasmissione a campo luminoso e un'immagine di fluorescenza.
Coltivare P.lacuna in mezzo F2 sotto 50 RPM agitazione orizzontale in luce bianca per circa cinque giorni fino a quando la densità ottica stimata a 750 nanometri diventa 0,35. Conservare il campione a quattro gradi Celsius. Omogeneizzare i filamenti con ultrasuoni per un minuto alla massima potenza e ciclo di uno.
Misurare la densità ottica a 750 nanometri e trasferire otto millilitri del mezzo contenente P.lacuna in una capsula di Petri di sei centimetri. Attendere qualche minuto fino a quando il campione raggiunge la temperatura ambiente e poi coprire la capsula di Petri con un foglio di cellophane. Posizionare un vetrino per microscopio sul tavolo X-Y di un microscopio standard con una fotocamera.
Accendere la luce del microscopio e spostare un obiettivo 4X o 10X nel percorso della luce. Quindi, posizionare la capsula di Petri sopra la diapositiva. Regola i singoli filamenti o i fasci di filamenti in base ai movimenti X, Y e Z del tavolo.
Osserva i movimenti di singoli filamenti o fasci e registra i movimenti con una fotocamera al microscopio standard. Assicurarsi che la lente dell'obiettivo non tocchi il liquido. Pipetta 0,5 millilitri di una soluzione contenente P.lacuna sulla superficie di Bacto agar di una capsula di Petri di sei centimetri.
Lasciare che il liquido entri nella superficie. Dopo circa 20 minuti, chiudi la capsula di Petri e osserva il movimento dei filamenti sulla superficie usando un obiettivo 4X o 10X. Cattura le registrazioni time lapse utilizzando una fotocamera oculare e un sistema di mini-computer.
I filamenti devono prima essere messi a fuoco ad occhio e poi attraverso la fotocamera oculare. Assicurarsi che l'intervallo di tempo tra le immagini successive sia compreso tra cinque secondi e un minuto. Programmare lo script Linux del mini-computer per controllare la registrazione time lapse.
Preparare i supporti LED in cui sono montati i LED da cinque millimetri per irradiare un'area di 20 millimetri quadrati dal basso verso l'alto. Misurare e regolare le intensità del LED. Assicurarsi che l'intera impostazione si trovi in una stanza buia o in un contenitore chiuso e buio.
Posizionare otto millilitri del mezzo contenente P.lacuna in una capsula di Petri di sei centimetri, chiudere la capsula di Petri con il coperchio e posizionarla su un supporto LED in modo che il LED si trovi al centro della capsula di Petri. Dopo in genere due giorni, cattura un'immagine della capsula di Petri con una fotocamera dello smartphone puntata direttamente sulla posizione del trattamento della luce. Utilizzare un supporto e un foglio bianco come sfondo per garantire la stessa distanza e le stesse condizioni di luce per ogni immagine.
Aprire il software ImageJ, fare clic su File, Apri e selezionare il file. Quindi, fare clic su Invio. Selezionare il pulsante dritto e premere il pulsante sinistro del mouse per disegnare una linea da un'estremità della capsula di Petri all'estremità opposta.
Assicurarsi che la linea passi attraverso il centro del cerchio di filamenti. Clicca su Analizza e misura per vedere la lunghezza della capsula di Petri. Quindi, fare clic su Analizza e traccia profilo nel menu ImageJ.
Stimare un valore medio per l'intensità dei pixel all'esterno del cerchio e un altro valore medio per l'intensità dei pixel all'interno del cerchio. Puntare il mouse sulla posizione Y tra questi valori per stimare i valori X di entrambi i lati del cerchio. Annotare entrambi i valori e calcolare la differenza.
Quindi selezionare il pulsante dritto e disegnare una linea al valore medio-massimo dell'intensità dei pixel. Infine, fai clic su Analizza e quindi su Misura per ottenere la lunghezza del cerchio cellulare interno. L'integrazione e la segregazione dell'inserto dopo la trasformazione di P.lacuna con PAK1 è mostrata qui.
Un test PCR con primer esterni circa una settimana dopo la trasformazione ha tipicamente due bande sul gel di elettroforesi, una con le dimensioni della banda wild-type e una banda migrante più lenta che indica l'inserimento della cassetta di resistenza. Qui, le corsie da 1 a 4 rappresentano i prodotti PCR di filamenti dopo sette giorni, 11 giorni, 14 giorni e 17 giorni dall'isolamento di un filamento resistente, e la corsia 5 rappresenta il prodotto PCR di tipo selvatico. Nel campione di sette giorni, l'inserto è presente in una piccola frazione dei cromosomi.
Questa frazione aumenta fino a 17 giorni, dove non è visibile alcuna banda wild-type; cioè, la segregazione è completa. Questa immagine rappresenta il vettore pMH1 per l'espressione di sfGHP sotto il controllo del promotore beta ficocianina endogena. La sequenza omologa P.lacuna, la spina dorsale vettoriale pUC19 e l'inserto con resistenza sfGFP e kanamicina sono mostrati qui.
In pMH1, il gene sfGHP è posto tre primi del gene ficocianina beta; quindi, è guidato dal promotore endogeno cpc beta. Le immagini di fluorescenza dei filamenti wild-type P.lacuna e dopo la trasformazione con PAK1, PAK2, PAK3 e pMH1 sono mostrate qui. L'espressione di sfGFP è guidata dal promotore cpc 560, dal promotore a2813, dal promotore psbA2S o dal promotore beta cpc endogeno.
Le immagini unite qui presentate mostrano la motilità della lacuna di Phormidium. Il movimento sulla superficie dell'agar è mostrato qui. L'intervallo di tempo era di un minuto.
Il movimento nel mezzo liquido è presentato qui. L'intervallo di tempo era di 10 secondi. La trasformazione naturale è un metodo semplice.
Basta mescolare il DNA plasmidico con una cassetta di resistenza in sequenze omologhe con le cellule e lasciare che le cellule crescano su un terreno con antibiotici. I geni possono essere inattivati e le proteine possono essere sovraespresse. Questo è importante per qualsiasi ricerca di base e per gli studi biotecnici.
Nei cianobatteri a singola cellula in cui è anche stabilita la trasformazione naturale, sono stati affrontati studi molecolari sulla fotosintesi o sui fotorecettori, eccetera.
