CUT&RUN是一种确定染色质上蛋白质定位的强大技术，在这里我们以手动96孔格式描述了该技术的单细胞版本。大多数蛋白质定位技术，如ChIP-seq，需要高细胞输入，大约需要三天才能完成。CUT&RUN由于具有高信号和低背景，已针对低电池和单电池应用进行了优化，并且可以在一天内完成。
我们设想该技术几乎可以应用于任何生物样品，并且可以特别有效地确定稀有和低丰度样品（例如珍贵患者样品）中的因子定位。在进行任何单细胞实验之前，请在大量非珍贵细胞上测试抗体和技术。该实验的主要局限性是对强效抗体的依赖。
证明该程序的是桑塔纳·拉多（Santana Lardo），他是我实验室经验丰富的研究专家。将单个细胞分选并将细胞核结合到磁珠上后，将96孔板放在96孔磁架上，让磁珠结合至少五分钟。然后，取出并丢弃上清液。
向细胞核结合的微球中加入100微升封闭缓冲液，与温和移液混合，并在室温下孵育五分钟。将板放在96孔磁性架上，让上清液清除至少五分钟。然后，除去并丢弃上清液而不干扰磁珠。
从磁性架上取下板，并在每次反应中将磁珠重悬于100微升洗涤缓冲液中，轻轻移液。将板放回96孔磁性架上，让上清液清除，然后取出并丢弃上清液。每次反应将微球重悬于25微升洗涤缓冲液中，轻轻移液。
通过每次反应等分25微升洗涤缓冲液，然后每次反应加入0.5微升抗体来制作一抗主混合物。加入25.5微升抗体洗涤缓冲液混合物，然后轻轻移液到用靶向目标蛋白质的抗体处理的每个样品上。在室温下孵育一小时。
然后，再次将样品放回96孔磁性架上。一旦上清液清除，将其取出并丢弃，而不会干扰珠子。从磁性架上取下板后，用100微升洗涤缓冲液洗涤珠子，并通过移液重悬。
将板放回96孔磁性架上并如上所述丢弃上清液后，将每个样品重悬于25微升洗涤缓冲液中。通过每次反应加入25微升洗涤缓冲液和优化量的蛋白质A MNase来制造蛋白质A MNase主混合物。向每个样品（包括对照样品）中加入25微升蛋白质A MNase主混合物。
将样品在室温下孵育30分钟。将板放在 96 孔磁性支架上。让上清液清除至少五分钟，然后除去并丢弃上清液而不干扰磁珠。
从磁性架上取出板后，用100微升洗涤缓冲液洗涤珠子，并通过轻柔移液重悬。将板放在96孔磁性架上，并如前所述丢弃上清液。然后，从磁性架上取出样品，并通过轻柔移液将磁珠重悬于50微升洗涤缓冲液中。
将样品在冰水混合物中平衡至零摄氏度五分钟，然后将样品从冰水浴中取出。使用多通道移液器加入一微升100毫摩尔氯化钙。使用大容量多通道移液器轻轻移液，充分混合三到五次，然后将样品返回零摄氏度。
一旦板回到冰水浴中，就启动10分钟的计时器。通过将含有两倍浓度的RSTOP +和缓冲液的溶液移液到每个孔中以与加入氯化钙相同的顺序移液50微升来停止反应。将样品在37摄氏度下孵育20分钟。
在四摄氏度下以16， 000倍G旋转板五分钟。将板放在 96 孔磁性支架上。让上清液清除至少五分钟。
然后，将上清液转移到新鲜的96孔板中并丢弃磁珠。对于DNA提取，向每个样品中加入一微升10%SDS和0.83微升每毫升蛋白酶K20毫克，并通过温和移液混合样品。将样品在70摄氏度下孵育10分钟。
将板恢复到室温。加入46.6微升五摩尔氯化钠和90微升50%PEG4000，轻轻移液混合。向每个样品中加入33微升聚苯乙烯磁铁矿珠，并在室温下孵育10分钟。
将板放在磁性架上，让上清液清除约五分钟。然后，小心地丢弃上清液而不干扰珠子。用150微升80%乙醇冲洗两次，而不会干扰珠子。
以1000倍G短暂旋转平板30秒。将板放回96孔磁性架上，并在不干扰磁珠的情况下除去所有残留的乙醇。将样品风干约两到五分钟。
将磁珠重悬于37.5微升pH 8的10毫摩尔TRIS盐酸盐中，并在室温下孵育5分钟。将板放回磁性架上，让磁珠粘合五分钟。将36.5微升上清液转移到与新鲜热循环仪相容的96孔板中，并丢弃磁珠。
在进行细胞质量评估后，检查了细胞外观和百分比，表明不应使用低质量的胚胎干细胞。使用Hoechst 33342染色进行单细胞分选，并对测试细胞进行计数以确保在每个孔中发现零个或一个细胞。琼脂糖凝胶分析揭示了低分子量分子量标和单个单细胞uliCUT&RUN文库。
次优和最优文库分析显示低分子量阶梯，由于Mnase消化效率低下而导致的次优文库，以及具有适当消解的成功文库。片段分析仪分布表明，单细胞的预期大小范围为150至500个碱基对。然而，在大蛋白质中，DNA将有大约270个碱基对。
使用描述高细胞数或阴性对照的单位点基因组浏览器的蛋白质占用和单细胞CTCF uliCUT&RUN显示，单细胞在很大程度上代表强峰，类似于高细胞uliCUT&RUN。单细胞CTCF或阴性对照的热图揭示了直接在细胞中已建立的CTCF结合位点上进行读富集的清晰模式。一维热图显示，相对于周围区域和无抗体对照，单细胞库中已建立的CTCF结合位点具有更高的读取密度，证明了已建立结合位点的抗体特异性富集。
平衡冰水浴上的珠子结合核，并且在添加氯化钙时不使样品过热对于防止染色质过度消化非常重要。
