CUT&RUN es una técnica poderosa para determinar la localización de proteínas en la cromatina, y aquí describimos una versión unicelular de esta técnica en un formato manual de 96 pocillos. La mayoría de las técnicas de localización de proteínas, como ChIP-seq, requieren una alta entrada de células y tardan aproximadamente tres días en completarse. CUT&RUN, debido a la alta señal y el bajo fondo, se ha optimizado para aplicaciones de celda baja y de una sola celda, y se puede completar en un solo día.
Imaginamos que esta técnica se puede aplicar a casi cualquier muestra biológica y puede ser especialmente poderosa para determinar la localización de factores en muestras raras y de baja abundancia, como muestras de pacientes preciosos. Antes de realizar cualquier experimento de una sola célula, pruebe el anticuerpo y la técnica en un gran número de células no preciosas. La principal limitación de este experimento es la dependencia de un anticuerpo robusto.
Demostrando el procedimiento está Santana Lardo, un experimentado especialista en investigación de mi laboratorio. Después de clasificar las células individuales y los núcleos de unión a las perlas, coloque la placa de 96 pocillos en un bastidor magnético de 96 pocillos y permita que las perlas se unan durante un mínimo de cinco minutos. Luego, retire y deseche el sobrenadante.
Agregue 100 microlitros de tampón de bloqueo a las perlas unidas al núcleo, mezcle con pipeteo suave e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos y deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de cinco minutos. Luego, retire y deseche el sobrenadante sin molestar las cuentas.
Retire la placa del bastidor magnético y vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón de lavado por reacción con un pipeteo suave. Vuelva a colocar la placa en el bastidor magnético de 96 pocillos, permita que el sobrenadante se despeje y luego retire y deseche el sobrenadante. Resuspend las perlas en 25 microlitros de tampón de lavado por reacción con pipeteo suave.
Haga una mezcla maestra de anticuerpos primarios alícuota 25 microlitros de tampón de lavado por reacción y luego agregue 0.5 microlitros de anticuerpo por reacción. Agregue 25.5 microlitros de la mezcla tampón de lavado de anticuerpos, seguido de un pipeteo suave a cada muestra que se esté tratando con un anticuerpo dirigido a la proteína de interés. Incubar durante una hora a temperatura ambiente.
Luego, vuelva a colocar las muestras en el bastidor magnético de 96 pocillos. Una vez que el sobrenadante esté despejado, retírelo y deséchelo sin molestar las cuentas. Después de retirar la placa de la rejilla magnética, lave las perlas con 100 microlitros de tampón de lavado y vuelva a suspender mediante pipeteo.
Después de colocar la placa de nuevo en un bastidor magnético de 96 pocillos y desechar el sobrenadante como se demostró anteriormente, vuelva a suspender cada muestra en 25 microlitros de tampón de lavado. Haga una mezcla maestra de proteína A MNasa agregando 25 microlitros de tampón de lavado y una cantidad optimizada de proteína A MNasa por reacción. Agregue 25 microlitros de mezcla maestra de proteína A MNasa a cada muestra, incluidas las muestras de control.
Incubar las muestras durante 30 minutos a temperatura ambiente. Coloque la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos. Deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de cinco minutos y luego retire y deseche el sobrenadante sin molestar las perlas.
Después de retirar la placa de la rejilla magnética, lave las perlas con 100 microlitros de tampón de lavado y vuelva a suspender mediante pipeteo suave. Coloque la placa en un estante magnético de 96 pocillos y deseche el sobrenadante como se demostró anteriormente. Luego, retire las muestras del bastidor magnético y vuelva a suspender las perlas en 50 microlitros de tampón de lavado mediante un pipeteo suave.
Equilibre las muestras a cero grados Celsius en una mezcla de agua helada durante cinco minutos y luego retire las muestras del baño de agua helada. Agregue un microlitro de cloruro de calcio de 100 milimolares usando una pipeta multicanal. Mezcle bien de tres a cinco veces con pipeteo suave usando una pipeta multicanal de gran volumen y luego devuelva las muestras a cero grados centígrados.
Inicie un temporizador de 10 minutos tan pronto como la placa vuelva al baño de agua helada. Detenga la reacción mediante el pipeteo de 50 microlitros de una solución que contiene el doble de la concentración de RSTOP+ y tampón en cada pozo en el mismo orden en que se agregó el cloruro de calcio. Incubar las muestras durante 20 minutos a 37 grados centígrados.
Gire la placa a 16, 000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Coloque la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos. Deje que el sobrenadante se despeje durante un mínimo de cinco minutos.
Luego, transfiera los sobrenadantes a un plato fresco de 96 pocillos y deseche las cuentas. Para la extracción de ADN, agregue un microlitro de 10% SDS y 0.83 microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K a cada muestra y mezcle las muestras mediante pipeteo suave. Incubar las muestras durante 10 minutos a 70 grados centígrados.
Devuelva la placa a temperatura ambiente. Añadir 46,6 microlitros de cloruro de sodio cinco molares y 90 microlitros de 50%PEG4000 y mezclar mediante pipeteo suave. Agregue 33 microlitros de perlas de magnetita de poliestireno a cada muestra e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Coloque la placa en una rejilla magnética y deje que el sobrenadante se despeje durante unos cinco minutos. Luego, deseche cuidadosamente el sobrenadante sin molestar las cuentas. Enjuague dos veces con 150 microlitros de etanol al 80% sin molestar las perlas.
Gire la placa brevemente a 1000 veces G durante 30 segundos. Vuelva a colocar la placa en un bastidor magnético de 96 pocillos y retire todo el etanol residual sin molestar las perlas. Seque las muestras al aire durante unos dos a cinco minutos.
Resuspend las perlas en 37,5 microlitros de clorhidrato TRIS 10 milimolar de pH 8 e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Vuelva a colocar la placa en una rejilla magnética y deje que las cuentas se unan durante cinco minutos. Transfiera 36.5 microlitros del sobrenadante a una placa de 96 pocillos nueva compatible con termociclador y deseche las perlas.
Después de realizar la evaluación de la calidad celular, se examinó la apariencia y el porcentaje de células, lo que demuestra que no se deben utilizar células madre embrionarias de baja calidad. La clasificación de una sola célula se realizó utilizando la tinción Hoechst 33342, y las células de prueba se contaron para garantizar que se encontrara cero o una célula en cada pozo. El análisis de gel de agarosa reveló una escalera de bajo peso molecular y bibliotecas individuales de uliCUT&RUN unicelulares.
El análisis de biblioteca subóptimo y óptimo muestra una escalera de bajo peso molecular, una biblioteca subóptima debido a la digestión ineficiente de Mnase y una biblioteca exitosa con una digestión adecuada. La distribución del analizador de fragmentos muestra que el tamaño esperado de una sola célula oscila entre 150 y 500 pares de bases. Sin embargo, en proteínas grandes, el ADN tendrá alrededor de 270 pares de bases.
La ocupación de proteínas utilizando el navegador del genoma de un solo locus que representa un alto número de células o control negativo y CTCF uliCUT & RUN de una sola célula reveló que una sola célula representaba en gran medida picos fuertes, similares a los uliCUT & RUN de células altas. Los mapas de calor de CTCF unicelular o control negativo revelaron un patrón claro de enriquecimiento de lectura directamente sobre los sitios de unión a CTCF establecidos en las células. Los mapas de calor unidimensionales muestran una mayor densidad de lectura sobre los sitios de unión CTCF establecidos en bibliotecas de células individuales en relación con las regiones circundantes y los controles sin anticuerpos, lo que demuestra un enriquecimiento específico de anticuerpos en los sitios de unión establecidos.
Equilibrar los núcleos unidos a perlas en el baño de agua helada y no sobrecalentar la muestra con la adición de cloruro de calcio es importante para evitar la digestión excesiva de la cromatina.
