培养和遗传操纵昆虫致病线虫

维持和扩增致虫病理线虫的有效方案对于了解线虫致病性和宿主抗线虫免疫的分子基础至关重要。该协议使我们能够使用昆虫宿主梅洛内拉菌产生大量共生和轴性异性异性结节性细菌和碳甲壳类斯坦纳菌IJ。首先用一张滤纸覆盖培养皿，并加入大约10至15个梅氏菌幼虫。

使用移液管，将每10微升悬浮液中含有约25至50个感染性幼体的两毫升水分配到蜡虫上。并将培养皿在室温下存放在柜中。根据滤纸的水分，每两天加入一到两毫升水。

感染性幼体的蜡虫通常在48小时内死亡。在蜡虫感染幼虫后约10天准备White水陷阱。小心地将死去的昆虫转移到滤纸的未浸泡部分。

使用自来水填充底部培养皿，并放置一个15毫升管的盖子作为通风垫片。使用自来水代替软化或去离子水，以避免线虫聚集，并确保水阱中的水位达到培养皿高度的一半左右。当小培养皿中的水由于线虫而变得浑浊时，使用移液管将新一代感染性幼体移动到T25或T75细胞培养瓶中。

之后，加入高达40%体积的自来水或直到达到适当的密度。并将细胞培养瓶水平存放，以避免线虫充血。重复将感染性幼体转移到细胞培养瓶中并加水，直到感染性幼鱼在大约三到五天内停止从昆虫尸体中出现。

使用接种环，将温带光子 Ret16 冷冻培养物的几片刮到 MacConkey 板上，并条纹用于单个菌落。将板在28摄氏度下孵育两到三天。孵育后，在50毫升管中接种10毫升LB肉汤和MacConkey琼脂上的菌落，并在振荡培养箱中以28摄氏度孵育过夜。

孵育后，将100微升过夜培养物从50毫升管转移到新的微量离心管中，然后用900微升单强度PBS离心洗涤100微升过夜培养物，在1.5毫升微量离心管中，以17， 900克。倾析上清液。接下来，在单强度PBS中稀释培养物10倍，并将管子放在冰上。

现在，将蜡虫浸入70%乙醇溶液中。用纸巾干燥昆虫后，将它们放入50毫升管中。将管子放在冰上20分钟以固定蜡虫。

使用滤纸覆盖培养皿的上半部分和下半部分。使用覆盖有滤纸的培养皿盖作为注射的基础支撑。润湿底部培养皿的滤纸并将其转移到冰上，以帮助注射的蜡虫恢复。

将50微升冰冷的细菌移液到一块Parafilm上，然后准备一个22号精炼针头注射器，轻轻按压柱塞以除去针尖处的空气。在立体镜下将蜡虫靠近后端。将细菌培养物注入胸部背侧。

优选在平行于蜡虫的角质层正下方的两段之间的连接处，以尽量减少内部损伤并注意幼体如何开始凸起。接下来，将注射的昆虫转移到恢复培养皿中。一旦所有的昆虫都被注射并放入恢复皿中，将培养皿放在黑暗中。

蜡虫在注射后两天屈服，大约三到四天后出现砖红色。然而，棕色昆虫表明细菌感染不成功。在感染后七天，将具有特征性砖红色的昆虫转移到新鲜的滤纸衬里培养皿上，并重复产生共生线虫感染幼体。

要开始表面灭菌，通过离心收集足够的共生异质，异性关节炎细菌和候选轴质感染性幼鱼。要在1.5毫升离心管中制作沉淀，请在每个微量离心管中向颗粒中加入500微升5%漂白剂并反转管。孵育10分钟后，以17，900次g离心一分钟并除去上清液。

然后用一毫升无菌水洗涤颗粒。离心，除去上清液，再重复此过程四次。该图显示了经过斧化的异性带炎细菌线虫状态的评估结果。

来自储备培养物的异型韧带炎菌团携带共生光环状发光细胞。然而，没有相关光环发光细菌的线虫是轴闪的。为了保持实验的可重复性，请始终从新鲜菌落的细菌储备培养物中新鲜出条，并在其到达静止面之前取出过夜培养物。

只使用砖红色的画廊蜡虫作为怀特的捕水器，并丢弃其余的。在此程序之后，线虫可用于研究与昆虫免疫系统的相互作用。该技术为研究人员探索线虫寄生和宿主抗线虫免疫的分子基础铺平了道路。