鉴于目前大多数杀虫剂由于担心其对环境和人类健康的毒性作用而被逐步淘汰的情况，这种方法为如何大规模生产昆虫病原真菌的感染分生孢子以控制商业农业生态系统中的重要害虫提供了新的信息。该技术描述了用于在批量生产过程中确保EPF分生孢子最佳产量的方法。该方法有助于虫害综合治理和生物防治，为大规模生产的分生孢子对农业生态系统中破坏性杀虫剂的大规模管理的有效性提供见解。
该程序由Letodi Luki Mathulwe博士，Nomakholwa Faith Stokwe博士和Antoinette Paula Malan教授开发和演示。加热一升蒸馏水，并在达到沸点之前关闭热量。现在，加入30克葡萄糖，四克磷酸钾二元，20克酵母提取物，15毫升玉米浸泡液，并将内容物轻轻煮沸两到三分钟。
将总共100毫升培养基倒入九个不同的250毫升烧瓶中。在每个烧瓶上放一个棉絮塞，并用铝箔作为塞子盖住棉絮。将培养基在烧瓶中以121摄氏度高压灭菌55分钟。
之后，让烧瓶中的培养基冷却，并向每个烧瓶中的培养基中加入每毫升链霉素10毫克。从两到三周龄的真菌培养板中收集两到三个真菌分生孢子的细菌环，用于两种EPF分离物。在无菌条件下将真菌分生孢子转移到250毫升烧瓶中的每100毫升液体培养基中，并密封烧瓶。
将液体培养瓶在约25摄氏度的轨道振荡器上以140 RPM孵育三天，一旦培养物显示出高浊度和真菌囊孢子生长的迹象，就停止孵育。为了检测培养物中任何可能的细菌污染，在孵育24小时后从每个液体培养瓶中抽取100微升样品，并在每个分离物的三个SDA板上板。将板在正负25摄氏度的受控温度下孵育48小时。
使用一个小的聚氯乙烯废液管在高压灭菌袋的开口端为发酵袋创建一个颈部，并使用高压灭菌胶带固定管道。用无菌棉絮塞关闭管道，以便在发酵过程中进行足够的气体交换。使用煮熟的长粒白米作为Metarhizium pinghaense和Metarhisrhizium robertsii的囊孢子的固体基质介质。
对于每个发酵袋，加入一公斤大米和300毫升无菌蒸馏水。轻轻混合发酵袋的内容物。将它们放在外部高压灭菌袋中，以直立姿势放置，并在121摄氏度下高压灭菌55分钟。
高压灭菌后，让基质在无菌条件下冷却约45分钟。在层流下取下Metarhizium pinghaense和Metarhisiu robertsii的每个液体培养瓶的封闭，并在每个烧瓶的边缘燃烧10秒钟。将100毫升液体培养物倒入发酵袋中，方法是从脖子上取下棉絮。
将棉塞放回原处，并用橡皮筋固定的手术纸盖住袋子的颈部顶部。扭转袋子的顶部，通过摇晃和按摩操纵基质来混合袋子的内容物。通过在袋子中压平基材，在约25摄氏度下孵育袋子，以防止形成厚床。
接种和孵育后两至三天，当发生可见的菌丝生长和真菌对底物的结合时，通过按摩袋子的内容物来破坏发酵袋中的底物。发酵后，将孢子培养物转移到26至30公斤的牛皮纸袋中，并在试验中使用之前将真菌培养物干燥10至12天。为了提高纸袋的抗拉强度，水平切掉袋子顶部1/3，并衬在袋子的底部。
轻轻粉碎每个发酵袋中的底物。切掉每个袋子的角落，并通过切角留下的空间将整个培养物慢慢转移到纸袋上。为每个纸袋贴上标签，在每个袋子的顶端折叠两次，并用订书钉关闭以创建三角形帐篷结构。
将袋子放在丝状干燥架上，以便在约25摄氏度的受控温度和30%至40%的低湿度下适当，均匀地干燥，使用安装在收集盘上的三个嵌套筛子从培养物中收获真菌分生孢子。将干培养样品缓慢加载到ETS网35号和筛子上。在筛子上盖上盖子，以防止真菌分生孢子释放到空气中。
在筛子中加入10至12个玻璃弹珠，以协助真菌分生孢子通过网筛，避免分生孢子保留在筛子中，从而减少孢子回收。用电工胶带用胶带固定筛子接头并密封。将筛子放在装有粘性垫的振动筛上，以每分钟560至640次的振动将收集盘和筛子固定20至25分钟。
从收集盘中取出测试筛，收集分生孢子，并将收集的分生孢子存放在密闭和不透水的拉链锁袋中，以便长期储存。平均从片状大麦底物中收获约1.83克干Metarhizium robertsii分生孢子，而从底物中收获的Metarhizium pinghaense为零。没有从片状燕麦底物中收获任何一种Metarhizium物种的干燥真菌分生孢子。
在两种Metarhizium之间观察到从米粒中收获的每克平均分生孢子的估计差异显着。Metarhizium robertsii每克的平均分生孢子计数略高于Metarhizium pinghaense。两种Metarhizium在用过的水稻基质上存在的估计分生孢子数量上未观察到显着差异。
然而，水稻基质上的分生孢子略高于Metarhizium robertsii，两种Metarhizium在水稻基质培养物获得的总分生孢子产量方面没有显着差异。然而，Metarhizium pinghaense产生的分生孢子产量略高于Metarhizium robertsii，后者产生的分生孢子产量较低。该技术具有挑战性的部分是通过接种受污染的囊孢子接种物来污染底物。
因此，在工作时始终确保无菌。该演示可帮助学生有效地重现该技术，而不会出现可能导致整个过程终止的笨拙错误。
