使用水性一步交联和共纳米聚合合成刺激响应纳米凝胶

我们的方案在温和的水基反应条件下以一步交联和共聚技术合成亚 100 纳米蛋白质负载的纳米凝胶方面取得了重大进展。该技术的主要优点是能够在温和的条件下合成载蛋白纳米凝胶，避免刺激性有机溶剂和高温，从而保持生物有效载荷的完整性。首先用过滤的去离子水清洗玻璃器皿。

要干燥玻璃器皿，请将一个安全的喷嘴连接到通风柜侧面的压缩空气出口。牢牢握住样品瓶，将喷嘴放在里面并激活压缩空气以发射受控流。接下来，用去离子水填充 10 毫升玻璃瓶，并用橡胶隔膜密封。

要使水脱氧，请在气球中注入氮气，然后将针头连接到气球上。将其放在隔膜上并刺穿橡胶隔膜以允许氮气流动。此外，将出口针连接到培养瓶上，以保持一致的氮气流量。

接下来，将 BSA 或 Cy7 标记的 BSA 溶解在脱氧去离子水中。然后将此溶液添加到干净的 10 ml 玻璃样品瓶中。将 AETC 溶液添加到烧瓶中，并用另一个橡胶隔膜密封。

溶解丙烯酰胺和脱氧去离子水，并将该溶液添加到样品瓶的混合物中。然后将二硫键交联剂溶解在去离子水中，并将其添加到小瓶中的混合物中。用氮气冲洗混合物 20 分钟。

然后，将 SDS 溶解在脱氧去离子水中。使用充氮气的注射器，将其引入混合物中。接下来，将 TEMED 添加到反应混合物中。

让混合物在连续的氮气流中脱氧 3 分钟。将过硫酸铵溶解在一毫升脱氧去离子水中，并将其引入反应混合物中。然后在氮气气氛下密封培养瓶，并在室温下搅拌混合物 3 小时 30 分钟。

要终止反应，请从培养瓶中取出密封件。一旦混合物变得透明和无色，反应就结束了。为了纯化纳米凝胶，将反应混合物添加到 15 毫升离心过滤装置中。

用去离子水填充装置并离心以去除未反应的化学物质或未封装的有效载荷。在离心装置中加入 2 毫升去离子水以稀释纳米凝胶样品。将最终样品储存在 2 至 8 摄氏度下，以防止封装蛋白质降解。

取比色皿或一次性折叠的毛细管细胞进行分析。用过滤去离子水清洁它，然后吹气压缩空气以去除任何大的灰尘颗粒。然后用 50 至 100 微升样品填充比色皿，用 750 至 1， 000 微升过滤去离子水稀释。

要将比色皿插入 DLS 仪器，请打开样品室盖并握住比色皿的顶部边缘，以避免在光学窗口上留下指纹。将比色皿与仪器的光路正确对齐。然后关闭样品室以阻挡环境光。

使用 DLS 机器上的相关软件开始粒度测量。测量后，选择与样品相关的结果，包括 Z 平均值、平均 PI、每分钟计数率、zeta 电位和相关图形。确认相关函数显示平滑的 S 形曲线，表示样品均匀。

分析完成后，小心地从 DLS 仪器中取出比色皿。观察到与 BSA 蛋白相关的峰强度逐渐降低，表明蛋白质被包裹在纳米凝胶结构中。Cy7 标记的 BSA 负载纳米凝胶的物理化学表征在 50 至 100 纳米处显示单个确定的峰。

然而，空纳米凝胶表现出不一致且尺寸较大。高达 86% 的封装 Cy7 标记 BSA 在 48 小时内释放。另一方面，未添加谷胱甘肽的对照实验仅导致 15% 的蛋白质释放。

傅里叶变换红外分析表明，在纳米凝胶合成和谷胱甘肽孵育后分离的 BSA 保留了其结构，由 1， 662 厘米倒数的峰表示完整的 β 转角。然而，来自储存 30 天的纳米凝胶的 BSA 在 1， 613 厘米处显示出一个反向峰值，表明分子间 β 折叠结构和蛋白质聚集。圆二色谱显示出与天然 BSA 一样未改变的光谱，表明保留了 α 螺旋结构。

然而，30 天后分离的 BSA 特征峰的微小像差表明存在一些聚集。保持连续的氮气流对于防止氧气抑制自由基聚合至关重要。此外，为了成功合成，需要快速添加起始系统组件。

在此程序之后，可以通过与生理还原剂谷胱甘肽孵育的 DLS、TEM 和氧化还原响应性评估来进一步表征纳米凝胶大小的分布、形态和有效载荷释放动力学。