癌症治疗的一个严重障碍是由于生理障碍，治疗药物对更深的肿瘤细胞的访问有限。因此，强烈希望开发能够治疗生物屏障的新型分子转运蛋白以提高药物递送效率。该程序的目的是合成环状细胞穿透肽以增强细胞间的渗透。
该方法的优点是肽环化可以通过与半胱氨酸和树脂的取代反应轻松实现，而无需任何金属催化剂。与亲水性内酰胺或三唑交联相比，芳香交联的掺入改善了肽的整体疏水性，从而增强了其渗透性。首先，在通风橱中组装手动肽合成装置。
将三通旋塞阀放在真空歧管上并将它们连接到氮气。确保盖上未使用的入口。将 10 毫升聚丙烯柱连接到三通旋塞阀上，并使用橡胶移液器灯泡或通过废物收集器真空从聚丙烯柱中排出反应混合物或溶剂。
为了制备用于肽合成的树脂，将4至5毫升DMF加入所需量的树脂中，并将其转移到聚丙烯柱中，轻轻的氮气鼓泡30分钟以使树脂充分膨胀。沥干DMF，向树脂中加入4至5毫升50%吗啉/ DMF。轻轻地将氮气吹泡30分钟以除去N端Fmoc基团，然后沥干混合物。
通过向色谱柱中加入4至5毫升DMF并每次用氮气冒泡至少1分钟，彻底洗涤树脂三次。以同样的方式，用二氯甲烷洗涤树脂三次，用DMF洗涤三次。接下来，将 648.8 毫克 Fmoc 和 PBF 保护的精氨酸和 372.6 毫克 HATU 溶解在离心管中的 5 毫升 DMF 中。
加入348.4微升DIPEA以活化偶联反应，并将反应混合物转移到装有树脂的聚丙烯柱中。用氮气鼓泡轻轻搅拌混合物1至2小时，然后重复偶联反应一次。排干反应混合物，依次用DMF，二氯甲烷和DMF洗涤树脂三次，每次至少1分钟。
去除Fmoc保护基团并按照前面显示的程序清洗树脂，然后再偶联下一个氨基酸。接下来，使用与氨基酸偶联相同的过程将β-丙氨酸偶联作为FITC标记的间隔物，然后在黑暗中将FITC，DIPEA和DMF的混合物添加到聚丙烯柱中，以对树脂上的肽进行FITC标记。反应需要将近8个小时。
为了进行线性肽的环化，将三氟乙酸，三异丙基硅烷和二氯甲烷的混合物加入聚丙烯柱中2分钟，以选择性地除去半胱氨酸的三苯甲基保护基团。沥干混合物并重复该过程，直到淡黄色溶液变为无色，以完全去除三苯甲基保护基团。用DMF和二氯甲烷连续洗涤树脂至少三次，然后用DIPEA将4，4'双溴甲基联苯溶解在DMF中。
将溶液加入色谱柱中并反应4小时。用4至5毫升甲醇洗涤树脂两次，每次五分钟，然后用连续的氮气流干燥。对于含有半胱氨酸的肽，用三氟乙酸、三异丙基硅烷和水或三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇和水的有效裂解混合物处理树脂。
将肽结合树脂处理2至3小时以裂解肽，然后用氮气流小心地除去三氟乙酸。为了获得粗肽，向裂解的肽制剂中加入4至5毫升乙醚以沉淀粗肽，并以10， 000×g离心4分钟。小心地丢弃上清液，并在有效的通风橱中风干肽3分钟。
将小规模粗肽溶解在800微升乙腈中，然后用反相高效液相色谱和液相色谱-质谱分析。在带有组织培养板插入物的 12 孔室中的 2 毫升 DMEM 中接种 100， 000 个 HeLa 细胞，并在含有 37% 二氧化碳的 57 摄氏度加湿培养箱中孵育 24 小时。取出培养基，并在无FBS的DMEM中用1毫升10微摩尔FITC-R8或FITC-sR8-4在室中孵育细胞1小时。
之后，除去含有肽的培养基，并用1毫升PBS洗涤细胞三次。向腔室中加入 1 毫升新鲜的不含 FBS 的 DMEM，然后将 HeLa 细胞与组织培养板插入物在腔室中共同孵育，将 HeLa 细胞放在底部的圆形盖玻片上 2 小时。用2.5%戊二醛将HeLa细胞固定在圆形盖玻片上15分钟，然后用DAPI染色细胞15分钟。
最后，在荧光显微镜下观察盖玻片上的HeLa细胞。这里给出了FITC标记的线性R8肽和FITC标记的吻合R8肽的合成示意图。线性R8肽和吻合R8肽的HPLC和MS谱图如图所示。
吻合肽的保留时间明显长于线性类似物的保留时间，表明与疏水交联环合后肽的整体疏水性增强。该图形表示线性肽和吻合肽在25%FBS存在下的稳定性。与FBS孵育4小时后，环状R8保持77.3%的完整，而其线性对应物大部分降解，表明环状R8肽的蛋白水解稳定性增强。
此处显示了与3微摩尔FITC标记的线性R8肽和FITC标记的吻合R8肽孵育1小时后HeLa细胞和4T1细胞的活细胞荧光显微镜图像。可以看出，用芳香交联环状R8处理的细胞比用线性对应物处理的细胞表现出更高的细胞内荧光。流式细胞术分析也获得了类似的结果。
为了进一步研究环状R8是否赋予增强的细胞间渗透性，使用Transwell模型来模拟肽从一个细胞层到另一个细胞层的屏障通透性。环状R8明显表现出比线性R8肽更高的跨屏障穿透力，如细胞内荧光的显着增加所示。半胱氨酸和树脂的三苯甲基的完全脱保护对于随后的环化步骤很重要。
此外，由于空间位阻效应，环化效率还取决于特定的序列和肽的长度。在这种情况下，使用具有较低负载能力的树脂或在溶液相中稀释浓度下环化肽将是有帮助的。与线性肽相比，这些环肽显示出增强的细胞间通透性。
我们相信它们在克服生物屏障方面具有巨大的希望，并将用于分子在药物递送领域的进一步应用。
