一种简单的坑式检测方案，用于可视化和定量体外碎屑病再吸收

我们的方案描述了一种简单可靠的破骨碎屑再吸收测定方法。使用磷酸钙包被的细胞培养板可以很容易地制备和使用实验室可用的材料进行可视化。与不透明的骨或牙本质切片相比，磷酸钙涂层可以同时可视化吸收坑和细胞。

在该协议中，我们使用PBMC进行破骨细胞分化。然而，它也可以应用于其他细胞类型，如骨髓来源的单核细胞或Raw 264.7细胞。首先取平底96孔细胞培养板和移液300微升先前制备的磷酸钙溶液进入每个孔中。

然后，用盖子盖住板，并将板在37摄氏度下孵育三天。三天后，从预钙化的96孔细胞培养板中吸取预钙化溶液，并向每个孔中加入300微升磷酸钙溶液。用盖子盖住板，在37摄氏度下孵育一天。

然后将板倒置以倒出溶液，并用去离子水彻底清洗板三次。立即使用吹风机或压缩的二氧化碳或氮气干燥板，以保持均匀的表面。现在，在干净的工作台上用紫外线照射涂层板一小时。

立即使用涂层板或用Parafilm密封板并将其储存在室温下。用等体积的PBS稀释15毫升新鲜血液，并通过倒置或移液几次混合它们。然后在50毫升锥形管中取15毫升密度梯度溶液，倾斜管，并在15毫升密度梯度溶液上小心地层30毫升稀释的血液样品。

之后，在20摄氏度下以810倍G离心管，在20摄氏度下无断裂20分钟。然后吸出上层，使单核细胞层在界面处不受干扰。小心地将单核细胞层转移到新的50毫升锥形管中。

用PBS填充管，混合，并在20摄氏度下以300倍G离心10分钟。将PBMCs重新悬浮在含有每毫升20纳克巨噬细胞集落刺激因子的完全α-MEM中，并将2.5倍于每厘米见方PBMC的10至第五个细胞接种在烧瓶中。将磷酸钙包被板与50微升胎牛血清在37摄氏度下孵育一小时。

接下来，用PBS洗涤烧瓶两次，以从死细胞或非贴壁细胞中分离出破骨细胞前体，然后每75平方厘米烧瓶加入四毫升胰蛋白酶。30分钟后，通过加入四毫升完整的α-MEM停止消化，然后使用细胞刮刀小心地分离细胞。将细胞转移到50毫升管中，并使用计数室计数细胞的总数。

将试管以350倍G离心7分钟以沉淀细胞并重悬沉淀并完成含有M-CSF和RANKL的α MEM，以获得每毫升六个细胞的一次10倍。从磷酸钙包被板中抽取胎牛血清，每孔移液200微升细胞悬浮液。孵育后，用PBS洗涤细胞两次。

用4%多聚甲醛固定细胞10分钟，然后用PBS再次洗涤。对于染色，向固定细胞中加入透化缓冲液并孵育五分钟。为了染色肌动蛋白丝，将细胞与100微升Alexa Fluor 546标记的鬼球蛋白溶液在PBS中孵育30分钟，然后吸出染色溶液并使用100微升Hoechst染色细胞核10分钟。

用100微升10微摩尔钙黄绿素和PBS染色磷酸钙涂层10分钟。用PBS洗涤三次后，捕获图像。对于Von Kossa磷酸钙涂层染色，向每个孔中加入50微升5%硝酸银和去离子水，并将板在紫外线辐射下孵育一小时，直到孔底部的涂层变成棕色。

96孔板底部的磷酸钙涂层似乎均匀且粘附良好。在M-CSF和RANKL中在磷酸钙包被板上培养9天后，破骨细胞前体形成吸收坑和大破骨细胞。位于凹坑中的多核破骨细胞表达了高TRAP水平。

成熟的破骨细胞显示出三个或更多个细胞核的存在和明显的肌动蛋白环。绿色磷酸钙涂层存在黑色吸收坑。使用ROI管理器和图像J的多边形选择工具计算了破骨细胞的数量和大小，并在没有RANKL的情况下生长的破骨细胞前体的多边形选择工具不能形成再吸收坑，但M-CSF和RANKL促进了破骨凹坑的形成。

使用图像J量化了坑面积，立即用气流干燥涂层板有助于使均匀的磷酸钙涂层。否则，它很容易在井的中间形成较厚的涂层。