הפרוטוקול שלנו מתאר שיטה פשוטה ואמינה לבדיקת ספיגה אוסטאוקלסטית. ניתן להכין בקלות את השימוש בלוחות תרבית תאים מצופים סידן פוספט ולדמיין אותם באמצעות חומרים זמינים במעבדה. בניגוד לפרוסות עצם או דנטין אטומות, ציפוי הסידן פוספט מאפשר הדמיה של בורות ספיגה ותאים בו זמנית.
בפרוטוקול זה, אנו משתמשים ב- PBMCs להבחנה אוסטאוקלסטית. עם זאת, ניתן ליישם אותו גם על סוגי תאים אחרים כמו מונוציטים שמקורם במח העצם או תאי Raw 264.7. תחילה קחו צלחת תרבית תאים שטוחה של 96 באר ופיפטה 300 מיקרוליטרים של תמיסת סידן פוספט שהוכנה בעבר לתוך כל באר.
לאחר מכן, מכסים את הצלחת במכסה ומדגרים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים. לאחר שלושה ימים, שאפו את תמיסת הקדם-הסתיידות מ-96 לוחות תרבית התאים של 96 הקידוחים מראש והוסיפו 300 מיקרוליטרים של תמיסת סידן פוספט לכל באר. מכסים את הצלחות במכסה ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ליום אחד.
לאחר מכן הפוך את הצלחת כדי לשפוך את התמיסה ולשטוף ביסודיות את הצלחת שלוש פעמים עם מים deionized. יש לייבש את הצלחת באופן מיידי באמצעות מייבש שיער או פחמן דו-חמצני דחוס או גז חנקן כדי לשמור על משטח אחיד. כעת, הקרינו את הצלחת המצופה על ספסל נקי עם קרניים אולטרה סגולות למשך שעה.
השתמשו בצלחת המצופה באופן מיידי או אטמו את הצלחת עם Parafilm ואחסנו אותה בטמפרטורת החדר. לדלל 15 מיליליטרים של דם טרי עם נפח שווה של PBS ולערבב אותם על ידי היפוך או pipetting מספר פעמים. לאחר מכן קח 15 מיליליטרים של תמיסת שיפוע צפיפות בצינור חרוטי 50 מיליליטר, הטה את הצינור, ושכב בזהירות 30 מיליליטרים של דגימת דם מדוללת על 15 מיליליטרים של תמיסת שיפוע צפיפות.
מאוחר יותר, צנטריפוגה הצינור ברוטור דלי מתנדנד ללא הפסקה ב 810 פעמים G במשך 20 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שאפו לשכבה העליונה והשאירו את שכבת התא החד-גרעיני ללא הפרעה בממשק. העבירו בזהירות את שכבת התא החד-גרעינית לצינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר.
מלאו את הצינור ב-PBS, ערבבו וצנטריפוגה ב-300 פעמים G במשך 10 דקות ב-20 מעלות צלזיוס. השעיה מחדש של מחשבי PBM בגורם מגרה של אלפא-MEM שלם המכיל 20 ננוגרם למיליליטרים של מקרופאגים בגורם מגרה מושבת מקרופאגים, וזרע 2.5 פעמים 10 לתאים החמישיים לסנטימטר PBMCs מרובעים בבקבוקון. דגירה של הצלחות מצופות הסידן פוספט עם 50 מיקרוליטרים של סרום בקר עוברי בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
לאחר מכן, שטפו את הבקבוק פעמיים עם PBS כדי לנתק את מבשרי האוסטאוקלסט מתאים מתים או שאינם דבקים, ואז הוסיפו ארבעה מיליליטרים של טריפסין לכל בקבוקון של 75 סנטימטרים רבועים. לאחר 30 דקות, עצרו את העיכול על ידי הוספת ארבעה מיליליטרים של אלפא-MEM שלם, ואז נתקו בזהירות את התאים באמצעות מגרד תאים. מעבירים את התאים לצינור של 50 מיליליטר וסופרים את המספר הכולל של התאים באמצעות תא ספירה.
צנטריפוגה של הצינור ב-350 פעמים G במשך שבע דקות כדי לכדור את התאים ולבצע החייאה של הכדור ולהשלים את האלפא MEM המכיל M-CSF ו-RANKL כדי להגיע פי 10 לששת התאים למיליליטר. שאפו את סרום הבקר העוברי מהצלחת המצופה בסידן פוספט, ופיפטה 200 מיקרוליטרים של תרחיף התא לכל באר. לאחר הדגירה, לשטוף את התאים פעמיים עם PBS.
תקן את התאים עם 4% paraformaldehyde במשך 10 דקות ושטוף שוב עם PBS. לצורך צביעה, יש להוסיף מאגר חדירה לתאים הקבועים ולדגום אותם במשך חמש דקות. כדי להכתים את חוטי האקטין, דגירו את התאים עם 100 מיקרוליטרים של אלקסה פלואור 546 המסומנים בתמיסת פלואידין ב-PBS למשך 30 דקות, ואז שאפו לתמיסת ההכתמה והכתימו את הגרעינים באמצעות 100 מיקרוליטרים של Hoechst במשך 10 דקות.
ציפוי סידן פוספט עם 100 מיקרוליטרים של 10 קלצין מיקרומולרי ו- PBS למשך 10 דקות. לאחר שטיפה שלוש פעמים עם PBS, לצלם תמונות. עבור פון קוסה צביעה של ציפוי סידן פוספט להוסיף 50 microliters של 5% כסף חנקתי ומים deionized לכל באר, ודגירה את הצלחת תחת קרינה אולטרה סגולה במשך שעה אחת עד שהציפוי בתחתית הבארות הפך חום.
ציפוי הסידן פוספט בתחתית 96 לוחות הבאר נראה אחיד ודבק היטב. לאחר תשעה ימים של תרבית ב-M-CSF וב-RANKL על הלוחות המצופים בסידן פוספט, נוצרו מבשרי אוסטאוקלסטים בורות ספיגה ואוסטאוקלסטים גדולים. האוסטיאוקלסטים מרובי הגרעין הממוקמים בבורות ביטאו רמות גבוהות של TRAP.
האוסטיאוקלסטים הבוגרים הראו נוכחות של שלושה גרעינים או יותר וטבעת אקטין מובהקת. ציפוי הסידן הפוספט הירוק הראה נוכחות של בורות ספיגה שחורים. תמונות הפלואורסצנציה של אזור הבור נמדדו באמצעות כלי הסף של התמונה J.המספר והגודל של אוסטאוקלסטים חושבו באמצעות מנהל ROI וכלי בחירת המצולעים של מבשרי התמונה J.Osteoclasts שגדלו בהיעדר RANKL לא יכלו ליצור בורות ספיגה, אולם M-CSF ו- RANKL הקלו על היווצרות בורות אוסטאוקלסטוגניים.
ואזור הבור כומת באמצעות תמונה J.ייבוש מיידי של הצלחת המצופה בזרימת אוויר מסייע ביצירת ציפוי סידן פוספט אחיד. אחרת הוא נוטה ליצור ציפוי עבה יותר באמצע הבאר.
