يصف بروتوكولنا طريقة بسيطة وموثوقة لفحص ارتشاف العظام. يمكن بسهولة تحضير وتصور استخدام ألواح زراعة الخلايا المغلفة بفوسفات الكالسيوم باستخدام المواد المتاحة في المختبر. على النقيض من شرائح العظام أو العاج غير الشفافة ، يسمح طلاء فوسفات الكالسيوم بتصور حفر وخلايا الارتشاف في نفس الوقت.
في هذا البروتوكول ، نستخدم PBMCs للتمايز العظمي. ومع ذلك ، يمكن تطبيقه أيضا على أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الوحيدة المشتقة من نخاع العظم أو الخلايا الخام 264.7. أولا ، خذ صفيحة زراعة خلايا 96 بئرا مسطحة القاع وماصة 300 ميكرولتر من محلول فوسفات الكالسيوم المعد مسبقا في كل بئر.
ثم ، قم بتغطية اللوحة بالغطاء واحتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام. بعد ثلاثة أيام ، قم بشفط محلول ما قبل التكلس من ألواح زراعة خلايا البئر 96 المتكلسة مسبقا وأضف 300 ميكرولتر من محلول فوسفات الكالسيوم إلى كل بئر. غطي الألواح بغطاء واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة يوم واحد.
ثم عكس اللوحة لصب المحلول وغسل الطبق جيدا ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات. جفف اللوحة على الفور باستخدام مجفف شعر أو ثاني أكسيد الكربون المضغوط أو غاز النيتروجين للحفاظ على سطح موحد. الآن ، قم بتشعيع اللوحة المطلية على مقعد نظيف بالأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة.
استخدم اللوحة المطلية على الفور أو أغلق اللوحة باستخدام Parafilm وقم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة. تمييع 15 ملليلتر من الدم الطازج مع حجم متساو من PBS ومزجها عن طريق عكس أو سحب عدة مرات. ثم خذ 15 ملليلتر من محلول تدرج الكثافة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ، وقم بإمالة الأنبوب ، وقم بطبقة 30 ملليلتر بعناية من عينة الدم المخففة على محلول تدرج الكثافة 15 ملليلتر.
في وقت لاحق ، قم بالطرد المركزي للأنبوب في دوار دلو متأرجح دون كسر عند 810 مرات G لمدة 20 دقيقة عند 20 درجة مئوية. ثم قم بشفط الطبقة العليا تاركا طبقة الخلايا أحادية النواة دون إزعاج في الواجهة. انقل طبقة الخلايا أحادية النواة بعناية إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 ملليلتر.
املأ الأنبوب ب PBS واخلطه وأجهزة الطرد المركزي عند 300 مرة G لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. إعادة تعليق PBMCs في ألفا MEM كاملة تحتوي على 20 نانوغرام لكل ملليلتر عامل تحفيز مستعمرة البلاعم ، والبذور 2.5 مرة 10 إلى الخلايا الخامسة في السنتيمتر مربع PBMCs في قارورة. احتضن الألواح المغلفة بفوسفات الكالسيوم مع 50 ميكرولتر من مصل البقر الجنيني عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك ، اغسل القارورة مرتين باستخدام PBS لفصل السلائف العظمية عن الخلايا الميتة أو غير الملتصقة ، ثم أضف أربعة ملليلترات من التربسين لكل قارورة 75 سنتيمترا مربعا. بعد 30 دقيقة ، أوقف عملية الهضم بإضافة أربعة ملليلترات من ألفا ميم الكاملة ، ثم افصل الخلايا بعناية باستخدام مكشطة الخلايا. انقل الخلايا إلى أنبوب 50 ملليلتر واحسب العدد الإجمالي للخلايا باستخدام غرفة العد.
الطرد المركزي للأنبوب في 350 مرة G لمدة سبع دقائق لتكوير الخلايا وإنعاش الكريات وإكمال ألفا MEM التي تحتوي على M-CSF و RANKL للحصول على مرة واحدة 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر. استنشاق مصل البقر الجنيني من الصفيحة المطلية بفوسفات الكالسيوم ، وماصة 200 ميكرولتر من تعليق الخلايا لكل بئر. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.
إصلاح الخلايا مع 4 ٪ بارافورمالديهايد لمدة 10 دقائق وغسل مرة أخرى مع PBS. للتلطيخ ، أضف المخزن المؤقت للتخلل إلى الخلايا الثابتة واحتضنها لمدة خمس دقائق. لتلطيخ خيوط الأكتين ، احتضن الخلايا ب 100 ميكرولتر من محلول الفيلويدين المسمى Alexa Fluor 546 في PBS لمدة 30 دقيقة ، ثم استطلع محلول التلطيخ وصبغ النوى باستخدام 100 ميكرولتر من Hoechst لمدة 10 دقائق.
قم بتلطيخ طلاء فوسفات الكالسيوم مع 100 ميكرولتر من 10 ميكرومولار كالسين و PBS لمدة 10 دقائق. بعد الغسيل ثلاث مرات باستخدام PBS ، التقط الصور. بالنسبة لفون كوسا تلطيخ طلاء فوسفات الكالسيوم إضافة 50 ميكرولتر من نترات الفضة 5٪ والماء منزوع الأيونات إلى كل بئر ، واحتضان اللوحة تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعة واحدة حتى يتحول الطلاء الموجود في قاع الآبار إلى اللون البني.
يبدو أن طلاء فوسفات الكالسيوم في الجزء السفلي من لوحات الآبار ال 96 موحد وملتصق جيدا. بعد تسعة أيام من الثقافة في M-CSF و RANKL على الألواح المغلفة بفوسفات الكالسيوم ، شكلت سلائف osteoclast حفر ارتشاف وخلايا عظمية كبيرة. عبرت الخلايا العظمية متعددة النوى الموجودة في الحفر عن مستويات عالية من TRAP.
أظهرت الخلايا العظمية الناضجة وجود ثلاث نوى أو أكثر وحلقة الأكتين المتميزة. أظهر طلاء فوسفات الكالسيوم الأخضر وجود حفر ارتشاف سوداء. تم قياس صور التألق في منطقة الحفرة باستخدام أداة العتبة للصورة J.تم حساب عدد وحجم الخلايا العظمية باستخدام مدير عائد الاستثمار وأداة اختيار المضلع لسلائف الصورة J.Osteoclasts المزروعة في غياب RANKL لا يمكن أن تشكل حفر ارتشاف ، ومع ذلك فإن M-CSF و RANKL سهلت تكوين حفر osteoclastogenic.
وتم تحديد مساحة الحفرة كميا باستخدام الصورة J.يساعد تجفيف اللوحة المطلية على الفور بتدفق الهواء على صنع طلاء فوسفات الكالسيوم الموحد. خلاف ذلك ، فهي عرضة لتشكيل طلاء أكثر سمكا في منتصف البئر.
