使用重组酶聚合酶扩增结合CRISPR-Cas12a进行现场部署的亚洲 自由念珠 菌检测

黄龙兵，简称HLB。这是一种毁灭性的柑橘病害。在大多数柑橘生产国，如中国和美国，HLB是由韧皮部限制性细菌Liberibacter asiaticus引起的，缩写为CLas。

CLas的早期检测对于种植者促进早期干预和防止疾病传播非常重要。因此，我们开发了一种快速便携式HLB诊断的新方法，结合了重组酶聚合酶扩增和CRISPR-Cas12a系统。我们称之为CLas-DETECTR。

我们平台的灵敏度远高于PCR。此外，当使用叶片样品时，它显示出与qPCR相似的结果。与传统的CLas检测相比，我们的方法可以在90分钟内完成，并且在等温条件下工作。

结果也可以通过现场的手持式荧光检测设备进行可视化。CLas-DETECTR 包含四个步骤：溶液制备、柑橘总 DNA 分离、等温 DNA 扩增和可视化结果。此处显示了CLas-DETECTR测定的示意图。

缓冲液A，溶液B和溶液C按照协议中所述制备。为了节省时间并使该方法适用于现场CLas检测，采用基于大肠杆菌聚乙二醇的方法获得用于DNA扩增的粗植物提取物。该工具中使用了柑橘叶。

从叶子上打出几块叶盘。将叶盘放入 1.5 毫升的 Eppendorf 管中。然后，将200微升缓冲液A加入管中。

用塑料棒手动研磨叶盘直至光滑。让管子不受干扰 10 分钟。随后将上清液应用于DNA扩增。

对于等温DNA扩增，将步骤2.3中的1微L上清液和1微L乙酸镁加入溶液B中并充分混合。在实验室中，将它们在37度的简单培养箱中孵育15分钟。为了可视化结果，将步骤3.2中的10微升混合物加入溶液C中并充分混合。

将它们在 37 度培养箱中孵育 60 分钟。戴上护目镜，通过手持荧光检测装置观察绿色荧光信号。为了测试CLas-DETECTR的特异性，根癌农杆菌GV3101，柑橘黄单胞菌亚种的第一个纯菌落。

柑橘溃疡病的病原体柑橘和我们实验室分离的伯克霍尔德氏菌株1440用于提取其基因组DNA。然后将这三种细菌基因组DNA和CLas阳性的Newhall叶子基因组DNA进行CLas-DETECTR测试。为了测试CLas-DETECTR的灵敏度，使用PCR，CLas-DETECTR和qPCR检测一系列CLas DNA片段稀释液，如方案中所述，在特异性和灵敏度测试之后，使用CLas-DETECTR方法检测现场是否存在CLas。

从中国江西甘南师范大学校园种质资源苗圃中生长的纽霍尔甜橙树收集的叶子样本。还应用了qPCR，一种通常在实验室中使用的令人信服的CLas检测方法。来自HLB感染和未感染HLB的Newhall树的叶子样本，其中CLas的存在在我们的实验室中得到证实，进行了CLas-DETECTR测试。

绿色荧光信号在HLB感染的样本中被捕获，但在HLB未感染和阴性对照中没有被捕获。我们使用从其他细菌中提取的核酸确定了CLas-DETECTR的特异性。在CLas-DETECTR测定中，只有从CLas阳性Newhall叶中提取的gDNA显示出绿色荧光信号。

从根癌农杆菌GV3101，柑橘黄单胞菌亚种和伯克霍尔德氏菌株1440中提取的gDNA没有，这意味着CLas-DETECTR可以特异性检测CLas。我们还使用协议中列出的一系列CLas DNA稀释液测试了CLas-DETECTR的灵敏度。

PCR每兆升可检测201个拷贝。另一方面，CLas-DETECTR每兆升可以检测2.01个拷贝，这表明它可作为敏感的现场诊断。qPCR每兆升可检测0.201拷贝，Ct值高于36。

因此，当使用稀释的CLas特异性扩增子时，CLas-DETECTR的灵敏度比传统PCR高两个数量级，比qPCR低一个数量级。最后，重新考察了CLas-DETECTR在现场样品中的可行性，并比较了其与qPCR的灵敏度。在数字中，我们看到。

我们可以看到，当CLas浓度小于每兆升0.2拷贝时，Ct值高于36，这是一个非常低的浓度。15份样本中，qPCR检测的样本1、2、3、4、8、10、13和14的Ct值均小于36。观察到明显的绿色荧光信号。

另一方面，当qPCR检测的样品6、7、9、12和15的Ct值未定时，未观察到绿色荧光信号。此外，当qPCR检测到的样品5和11的CT值高于36时，观察到微弱的绿色荧光信号。结果表明，我们的平台是现场HLB诊断的快速，强大和灵敏的工具。