הואנג בינג ארוך, מקוצר כמו HLB. זו מחלת הדרים הרסנית ברחבי העולם. במדינות המייצרות ביותר הדרים, כמו סין וארה"ב, HLB נגרם על ידי החיידק המוגבל בפלואם Candidatus Liberibacter asiaticus, המכונה בקיצור CLas.
גילוי מוקדם של CLas היה חשוב למגדלים כדי להקל על התערבות מוקדמת ולמנוע התפשטות מחלות. אז כאן פיתחנו שיטה חדשה לאבחון HLB מהיר ונייד, בשילוב עם הגברה של רקומבינאז פולימראז ומערכת CRISPR-Cas12a. קראנו לזה CLas-DETECTR.
הרגישות של הפלטפורמה שלנו גבוהה בהרבה מ- PCR. יתר על כן, הוא מראה תוצאה דומה עם qPCR כאשר נעשה שימוש בדגימות העלים. בהשוואה לגילויי CLas הקונבנציונליים, ניתן לסיים את השיטה שלנו תוך 90 דקות, והיא עובדת במצב איזותרמי.
ניתן גם לדמיין את התוצאה באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני בשטח. ה- CLas-DETECTR מכיל ארבעה שלבים: הכנת תמיסה, בידוד DNA כולל של הדרים, הגברה איזותרמית של דנ"א ותוצאות הדמיה. הסכימה של בדיקת CLas-DETECTR מודגמת כאן.
מאגר A, פתרון B ופתרון C מוכנים כמתואר בפרוטוקול. כדי לחסוך זמן ולהפוך שיטה זו למתאימה לזיהוי CLas בשדה, הגישה המבוססת על פוליאתילן גליקול E.coli שימשה להשגת תמציות צמחים גולמיות להגברת DNA. עלי הדרים משמשים בכלי.
מנקבים את החתיכות המעטות של דיסקיות העלה מהעלה. שים דיסקיות עלים לתוך צינור אפנדורף 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטר של חיץ A לתוך הצינור.
טוחנים את דיסקיות העלים עד לקבלת מרקם חלק בעזרת מוט פלסטיק ידני. השאירו את הצינור ללא הפרעה למשך 10 דקות. הסופר-נטנט מוחל לאחר מכן על הגברה של הדנ"א.
להגברת DNA איזותרמית, הוסיפו מיקרוליטר אחד של סופרנטנט משלב 2.3 ומיקרוליטר אחד של מגנזיום אצטט לתמיסה B וערבבו היטב. במעבדה, לדגור אותם באינקובטור פשוט ב 37 מעלות במשך 15 דקות. כדי להמחיש את התוצאות, הוסיפו 10 מיקרוליטר של התערובת משלב 3.2 לתמיסה C וערבבו היטב.
לדגור אותם בחממה 37 מעלות במשך 60 דקות. הרכיבו משקפי מגן, והתבוננו באות הפלואורסצנטי הירוק באמצעות מכשיר זיהוי פלואורסצנטי ידני. כדי לבחון את הספציפיות של CLas-DETECTR, המושבות הטהורות הראשונות של אגרובקטריום טומפצ'ינס GV3101, Xanthomonas citri subsp.
citri שהוא הפתוגן של קנקן ההדרים וזן Burkholderia stabilis 1440 שבודדו במעבדה שלנו שימשו לחילוץ הדנ"א הגנומי שלהם. לאחר מכן, הדנ"א הגנומי של שלושת החיידקים והדנ"א הגנומי של ניוהול חיובי ל-CLas, היו נתונים לבדיקת CLas-DETECTR. כדי לבחון את הרגישות של CLas-DETECTR, זוהתה סדרה של דילולים של מקטעי דנ"א של CLas באמצעות PCR, CLas-DETECTR ו- qPCR כמתואר בפרוטוקול לאחר בדיקת הספציפיות והרגישות, נעשה שימוש בשיטת CLas-DETECTR כדי לזהות את נוכחות ה- CLas בשדה.
דגימות עלים שנאספו מעץ תפוז מתוק של ניוהול שגדלו במשתלת משאבי הנבטים בקמפוס של אוניברסיטת Gannan Normal, ג'יאנגשי, סין. qPCR, שיטת זיהוי CLas משכנעת המשמשת בדרך כלל במעבדה יושמה גם היא. דגימות העלים מעץ ניוהול הנגוע ב-HLB ומעץ ניוהול שאינו נגוע ב-HLB, שבו אושרה נוכחות ה-CLas במעבדה שלנו, היו נתונות לבדיקת CLas-DETECTR.
אות הפלואורסצנציה הירוק נלכד בדגימה הנגועה ב-HLB, אך לא בבקרה הלא נגועה והשלילית של HLB. קבענו את הספציפיות של CLas-DETECTR באמצעות חומצות גרעין המופקות מחיידקים אחרים. בבדיקת CLas-DETECTR, רק gDNA שחולץ מעלי ניוהול חיוביים ל-CLas הדגים אותות פלואורסצנטיים ירוקים.
gDNA המופק מ- Agrobacterium tumefaciens GV3101, Xanthomonas citri subsp. citri ו- Burkholderia stabilis זן 1440 לא, מה שאומר ש- CLas-DETECTR יכול לזהות CLas באופן ספציפי. בדקנו גם את הרגישות של CLas-DETECTR באמצעות סדרה של דילולי דנ"א CLas, המפורטים בפרוטוקול.
PCR יכול לזהות 201 עותקים למגה-ליטר. מצד שני, CLas-DETECTR יכול לזהות 2.01 עותקים למגה-ליטר, מה שמרמז על זמינותו כאבחון שדה רגיש. qPCR יכול לזהות 0.201 עותקים למגה-ליטר וערך ה-Ct גבוה מ-36.
אז CLas-DETECTR הוא שני סדרי גודל רגישים יותר מאשר PCR מסורתי וסדר גודל אחד פחות רגיש מאשר qPCR כאשר נעשה שימוש באמפליקונים ספציפיים של CLas מדולל. לבסוף, בחן מחדש את ההיתכנות של CLas-DETECTR לדגימות שדה, והשווה את רגישותו ל- qPCR. במספרים, אנו רואים.
אנו יכולים לראות כי ערך Ct גבוה מ 36 כאשר ריכוז CLas הוא פחות מ 0.2 עותקים למגה ליטר, שהוא ריכוז נמוך מאוד. מבין 15 הדגימות, ערך ה-Ct של הדגימות 1, 2, 3, 4, 8, 10, 13 ו-14 שזוהו על ידי qPCR היה פחות מ-36. נצפתה לכאורה אותות פלואורסצנטיים ירוקים.
מצד שני, כאשר ערך ה- Ct של הדגימות 6, 7, 9, 12 ו- 15 שזוהו על ידי qPCR לא נקבע, לא נצפו אותות פלואורסצנטיים ירוקים. בנוסף, אותות פלואורסצנטיים ירוקים חלשים נצפו כאשר ערך ה- CT של מדגם 5 ו - 11 שזוהה על ידי qPCR היה גבוה מ -36. התוצאות יצביעו על כך שהפלטפורמה שלנו היא כלי מהיר, חזק ורגיש לאבחון HLB בתחום.
