在膜上重构隔膜组件以研究生物物理性质和功能

该协议将指导那些从事膜结合蛋白工作的人确定膜形状如何在蛋白质组装的组织中发挥作用。该技术的主要优点是其在蛋白质类型、膜组成和膜几何形状方面的多功能性。它还允许询问脂质双层如何改变相关蛋白质的性质。

为了确定适合实验的膜，我们建议建立一个清单，其中可能包括脂质扩散速率，目标蛋白质的迁移率，以及是否有未破裂的脂质体或融合的脂质体粘在表面。要开始对载玻片进行等离子清洁，请用氧气吹扫等离子清洁器五分钟，以去除管路和腔室中的空气。将干燥的盖玻片载玻片排列到陶瓷支架中。

吹扫时，将惰性气体流过微型盖玻片载玻片，以去除灰尘和颗粒。将支架放在等离子体室的背面，使盖玻片与腔室的长边缘平行。以最大功率用氧气运行等离子清洁器15分钟。

对于腔室制备，切下 0.2 毫升 PCR 管磨砂部分下方的盖子。用紫外线激活粘合剂涂漆PCR管的边缘，避免进入管内。轻轻地将PCR管胶水放在等离子清洁盖玻片的中心，然后将腔室置于长波长紫外线下五到七分钟以固化粘合剂。

要形成双层，请将试剂添加到孔中。轻轻左右摇晃腔室以破坏 SUV，然后在 37 摄氏度下孵育 20 分钟。孵育后，通过移液用150微升SLBB冲洗双层六次以洗去多余的脂质，然后用150微升反应缓冲液洗涤双层六次，然后与隔膜一起孵育。

在最后一个洗涤步骤中，除去反应缓冲液，在孔中留下75微升。加入 25 μL 在 SSB 中稀释的隔膜素，并通过 TIRF 显微镜成像。首先，涡旋含有二氧化硅微球的瓶子15秒，然后浴超声处理一分钟，然后再次涡旋15秒以打破任何团簇。

将珠子与SLBB和10微升五毫摩尔SUV在低粘附微量离心管中混合。将珠状脂质混合物在室温下在摇床上孵育一小时以防止沉淀。同时，解冻聚乙二醇化的盖玻片并将切好的0.2毫升PCR管粘在其上。

孵育后，在指定的RCF下将珠子离心30秒。第一次旋转后，除去50微升上清液，然后加入200微升PRB并通过剧烈移液混合。对于下一轮，去除 200 微升 PRB，并在第二次和第三次旋转后再添加 200 微升，并在第四次旋转后添加 220 微升 PRB。

如果使用多个磁珠尺寸进行竞争测定，则通过将等体积的每个磁珠尺寸混合并将29微升该珠混合物与721微升反应缓冲液稀释来制备反应，然后将75微升稀释的珠子和25微升在SSB中稀释的蛋白质加入孔中并混合。如果在稳定状态下测量隔膜素，请将混合物在室温下孵育一小时，然后通过TIRF附近或共聚焦显微镜成像。与绿色隔膜一起孵育的平面SLB的TIRF显微照片显示均匀的蛋白质分布。

用清洁不良的玻璃盖玻片制成的SLB在低隔膜区域的双层中显示出孔洞或间隙。如果使用旧脂质体或洗涤不严格，未爆裂和管状脂质体可能会积聚在表面上。在使用罗丹明PE可视化的脂质包被微球的显微照片中，显示出光滑的双层沉积。

球形支撑物均匀地被膜覆盖，并且很少有珠簇。过量脂质的洗涤不充分导致膜涂层不均匀，如脂质团块所观察到的那样，处理不当导致双层间隙。磁珠混合不充分导致结块，这对于测量总蛋白质吸收并不理想。

使用此处介绍的支持脂质双层，可以执行其他方法，例如荧光寿命成像显微镜，膜质细胞术和高速原子力显微镜，以检查不同的蛋白质 - 蛋白质或蛋白质 - 膜动力学。