自下而上的 体外 方法测定隔膜的超微结构组织、膜重塑和曲率敏感性行为

使用该协议，我们可视化了显示各种曲率的图案底物上的细胞骨架丝状蛋白的组织。我们可以测试曲率灵敏度。扫描电子显微镜图像的分辨率足够高，因此纳米级组织是可视化的。

我们用于固定的方法足够温和，可以保留蛋白质的结构内组织。这仍然是了解细胞骨架细丝行为的基础研究范围。首先在洁净室环境中设计一种波浪形的诺兰德光学粘合剂或NOA复制品，由波浪形聚二甲基硅氧烷波浪图案制成，波浪形的波浪形聚二甲基硅氧烷波浪图案具有250纳米的振幅和2微米的横向周期性。

为此，将五微升液体NOA沉积在直径为一厘米的圆形玻璃盖玻片上，然后将PDMS模板放在液滴上。用320纳米的紫外光处理组件五分钟，将液体NOA光聚合成薄聚合物膜。完成后，用新鲜聚合的NOA从盖玻片上轻轻剥离PDMS模板。

使用空气等离子清洁剂处理NOA膜五分钟，使表面亲水。如手稿中所述，制备小单层囊泡或SUV的溶液，并通过在浴超声仪中超声处理下将干燥的脂质膜重悬于观察缓冲液中5至10分钟，直到溶液透明。之后，将支持NOA模式的盖玻片插入细胞培养盒的孔中，并将新鲜发光的NOA模式与100微升每毫升1毫克SUV溶液在室温下孵育30分钟以产生支持的脂质双层。

要取出未熔断的SUV，请使用隔膜低盐缓冲液彻底冲洗侧面六次，不要让样品在两次洗涤之间完全干燥。将八聚体隔肽储备溶液在隔膜低盐缓冲液中稀释至终浓度，范围为 10 至 100 纳摩尔，体积为 1 毫升。然后，将蛋白质溶液在载玻片上在室温下孵育一小时。

清洗含有融合支持的脂质双层的NOA载玻片，并用隔膜低盐缓冲液孵育蛋白质。在0.1摩尔二甲胂酸钠缓冲液中用2%戊二醛固定液替换隔肽低盐缓冲液，在37摄氏度下预热，让反应进行15分钟，将固定样品洗涤三次，每次用0.1摩尔二甲胂酸钠洗涤5分钟。洗涤后，将样品在四氧化锇固定溶液中孵育，然后是过滤的单宁酸，最后是过滤的乙酸铀酰，每次10分钟。

每次溶液后用蒸馏水洗涤样品三次。将样品在从50%到100%的乙醇溶液中连续孵育，每次孵育两到三分钟。将载玻片转移到预装乙醇的临界点干燥器内，并按照制造商的说明进行干燥。

由于干燥的样品具有很高的吸水性，因此通过将盖玻片连接到存根上来立即涂覆它们。然后在盖玻片的上表面添加一条银色油漆，而不会产生油漆结块。确保与存根的连接令人满意。

当样品完全蒸发时，使用配备等离子磁控溅射头和旋转行星台的设备，并遵循制造商提供的标准协议。在 120 毫安下进行 60 秒的预溅射以去除表面的氧化层。然后用90毫安的薄膜厚度监视器沉积1.5纳米的钨，工作距离为50毫升。

之后，将样品储存在真空下，以保护它们免受环境空气的影响，直到并在整个SEM分析过程中。为了通过使用内陆探测器检测二次电子来实现高溶液成像，请将加速电压设置为3kV，将光束电流设置为20微米孔径。对于观察，请使用从每像素 21.25 纳米到每像素 1.224 纳米的分辨率。

使用每像素 5.58 纳米的分辨率进行数据分析。对于高分辨率观察，将工作距离设置为1到2毫米之间，如果需要增加景深，则设置在3毫米左右。连续调整扫描速度和线积分，以确保恒定的信噪比，每张图像的采集时间约为 30 至 45 秒。

代表性分析说明了沉积在隔膜细丝上的材料对1.5纳米铂和1.5纳米钨的波浪状PDMS图案的影响。据观察，裸露的巨型单层囊泡或GUV是完美的球形。在隔膜诱导的变形后，囊泡出现刻面，变形保持静止，因此没有波动。

在较高浓度的隔膜下，观察到囊泡中的周期性变形。用冷冻电子显微镜图像检查与大单层囊泡（LUV）结合的隔膜细丝的自组装，并从倾斜的系列中获得3D重建。隔膜细丝的曲率依赖性排列通过扫描电子显微镜可视化。

在低放大倍率下，可以看到具有负曲率和正曲率周期性的波浪图案。隔膜细丝的超微结构组织在更高的放大倍率下观察。NOA必须轻轻剥离以防止降解。

成像后，可以进行一些图像分析，以量化SCM可视化的超微结构特征，例如灯丝间距和灯丝的方向。本方法已应用于隔膜素，但它也可用于其他细胞骨架蛋白或组织成长丝的蛋白质，因此对曲率敏感。