小鼠星形胶质细胞的分离和直接神经元重编程

星形胶质细胞是一种有趣的自体细胞群，可靶向直接神经元编程。该协议提供了一种可靠的技术来分离来自不同区域或中枢神经系统的高纯度培养星形胶质细胞。该协议的设计和优化旨在研究星形胶质细胞重新编程为功能性神经元的能力，而不会混淆因素，例如不同启动群体的星形胶质细胞纯度差异。

演示该程序将由实验室的博士后Bob Hersbach和我们实验室的技术援助Tatiana Simon完成。首先，将安乐死小鼠的躯干放入35毫米培养皿中并将其放在冰上。用剪刀打开皮肤，用小剪刀去除椎骨。

然后提取脊髓并将其置于冰上的解剖缓冲液中。在具有两倍放大倍数的立体定向解剖显微镜下，使用镊子从分离的脊髓中取出脑膜，并将解剖和清洁的脊髓组织转移到C管中。从神经组织解离试剂盒中加入50微升酶P和30微升先前制备的酶混合物到每个C管中。

倒置C管并将它们放在加热的解离物上，确保所有组织都收集在管的盖子中。通过从分离器中取出色谱柱，加入800微升星形胶质细胞培养基，并用随附的柱塞将细胞推出色谱柱来躲避细胞。通过加入4.2毫升星形胶质细胞培养基，每毫升补充10纳克EGF和bFGF，将细胞平板在先前制备的培养瓶中。

没有必要在培养瓶中涂覆从其他大脑区域分离的星形胶质细胞，但它为从脊髓分离的星形胶质细胞提供了更好的底物。在37摄氏度和5%二氧化碳下培养细胞。在安全等级为一级的生物安全柜下进行星形胶质细胞座位，并按照文本手稿中所述使用聚-D-赖氨酸涂层玻璃盖玻片准备 24 孔板。

对于电镀，从P2小鼠中分离出六条脊髓，产生约100万个细胞。从含有培养的星形胶质细胞的T-12.5培养瓶中吸出培养基，并用1x PBS洗涤一次。通过加入0.5毫升0.05%胰蛋白酶EDTA从培养瓶中分离星形胶质细胞，并在37摄氏度下孵育5分钟。

轻轻敲击烧瓶的侧面以从培养瓶表面释放细胞，并在明场显微镜下使用10倍放大镜检查脱落。用2.5毫升星形胶质细胞培养基停止胰蛋白酶化，并在15毫升管中收集细胞悬液。在 300 RCF 下在 4 摄氏度下离心五分钟。

吸出上清液并在一毫升星形胶质细胞培养基中重新发送细胞。使用血细胞计数器或自动细胞计数系统计算细胞浓度。根据细胞数量，用补充有EGF和bFGF的新鲜星形胶质细胞培养基以每因子10纳克/毫升稀释细胞悬液。

在37摄氏度和5%二氧化碳下向先前制备的24孔板和培养细胞的每个孔中加入500微升细胞悬液。通过将一毫升B27补充剂添加到49毫升碱性培养基中来制备神经元分化培养基。24至48小时后，根据细胞是否已转导或转染，每孔用1毫升神经元分化培养基替换星形胶质细胞培养基。

用9%二氧化碳在37摄氏度下培养细胞。为了提高重编程效率，当用分化培养基替换星形胶质细胞培养基时，用佛司可林和背吗啡补充神经元分化培养基，最终浓度分别为30微摩尔和1微摩尔。当选择用佛司可林和背吗啡治疗细胞时，在初始治疗后两天提供第二剂背吗啡。

将第二种处理直接添加到培养基中。星形胶质细胞的原代培养物在磁辅助细胞分选和铺板后7至10天内达到80%至90%汇合度。电镀后的第二天，细胞通常覆盖50%至60%的盖玻片表面。

在这个阶段，培养物主要由星形胶质细胞组成，而其他细胞类型如神经原始细胞几乎不存在。在转导或转染后7天，诱导的神经元细胞与星形胶质细胞明显可区分。神经元细胞体小于未重编程的星形胶质细胞具有较长的过程，神经元标志物，β三微管蛋白呈阳性，星形胶质细胞标志物GFAP呈阴性。

在转导或转染后21天，许多诱导的神经元能够发射动作电位，并且对成熟的神经元标志物NeuN和泛突触蛋白Synaptophysin呈阳性。正确剖析感兴趣的区域至关重要。避免周围组织的污染。

必须注意从孤立的脊髓中去除脑膜和背根神经节。该方法可用于从中枢神经系统的各个区域分离星形胶质细胞，包括大脑皮层、背侧中脑和小脑。在未来，这项技术将使我们能够扩展我们对区域星形胶质细胞及其重新编程为功能性神经元的潜力的了解。