成人皮层的器官型培养作为人类干细胞移植和验证的 离体 模型

迄今为止，人类成人皮层的器官型培养物是测试受损皮层干细胞疗法的唯一系统，可以研究人类移植细胞和人类宿主细胞之间的相互作用。由于啮齿动物和人类细胞之间的差异，在动物模型中测试的疗法在转化为临床环境时通常会失败。在这里，我们可以在人与人的环境中研究移植细胞、存活、分化和功能。

这种方法将帮助我们了解神经回路在人脑中的运作方式，并将刺激这些知识转化为临床环境，以改善脑损伤后的功能恢复。演示该程序的将是来自我实验室的博士生Raquel Martinez-Curiel和硕士生Costanza Aretio-Medina。首先，在通风罩下的细胞培养实验室中使用镊子将培养插入物放入六孔板中。

在插入物底部加入五毫升人类成人皮质培养基，直到它接触膜。避免形成气泡，并在插入物顶部添加两毫升培养基。在将组织切片转移到插入物之前，在培养箱中以37摄氏度和5%二氧化碳平衡至少两个小时。

将手术室中患者的组织收集到装有冷冻、起泡和压碎的切割溶液的容器中。立即将冰上的封闭容器转移到实验室的切割区域。检查组织，并考虑皮质层的方向，找到最佳表面将其粘合到振动切片机的切割阶段。

如果需要，用手术刀切割不平坦的表面，将组织放在载物台上，以获得最佳切片方向。然后，用纸巾粘合剂将纸巾粘在载物台上。将其放入切片室中，并立即用冷的气泡切割溶液填充。

在整个切割过程中继续冒泡。现在根据手稿中描述的组织到刀片的方向切割冠状切片或矢状切片。将切片放入室温下带有鼓泡切割溶液的收集室中。

切割完所有组织后，将切片转移到带有室温冲洗溶液的无菌培养皿中，以从切片中去除多余的蔗糖并将其运送到细胞培养实验室。接下来，将组织切片分别放在湿插入物和浸没的插入物上。24 小时后，更换培养基以去除切割过程中残留的蔗糖或其他残留物质。

两周后，使用不含庆大霉素的成人皮质培养基。从细胞培养瓶中取出培养基。在分化的第七天，通过加入 500 微升胰蛋白酶分离皮质引发的 GFP-lt-NES 细胞，并在室温下孵育 5 至 10 分钟。

接下来，加入等体积的胰蛋白酶抑制剂，然后加入五毫升DDM培养基。重悬细胞，轻轻地将细胞悬液转移到15毫升管中，并以300G离心5分钟，同时将含有人体组织的板从培养箱转移到罩上，并从插入物顶部取出两毫升培养基。在离心结束时，除去上清液，将细胞重悬于冷，纯的基底膜基质中，并将养老金转移到较小的管中。

将细胞悬液收集到连接到橡胶奶嘴的冷玻璃毛细管中进行抽吸。通过在各个部位刺伤半干组织切片，将细胞悬液注射为微小滴剂。让凝胶在 37 摄氏度下凝固 30 分钟。

然后，将板从培养箱转移回罩，并小心地将两毫升人成人皮质培养基添加到插入物的顶部以完全浸没组织。急性人类成人皮质组织显示神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞的存在，显示出组织的最佳保存。细胞培养两周后，组织显示神经元标志物NeuN和Map2的表达。

全细胞膜片钳记录显示，神经元具有持续的静息膜电位和膜输入阻力，与急性制剂的神经元相当。这些细胞的活性略低于新鲜组织，尽管大多数细胞能够发射至少一个（如果不是多个）动作电位。急性皮质组织显示小胶质细胞标志物Iba1和Tmem119的表达。

培养两周后，小胶质细胞的分支减少，并且比急性组织更活化。离体移植4周后，移植的GFP-lt-NES细胞在整个器官型培养过程中表现出延伸的神经突，具有广泛而复杂的树化。几乎没有任何移植细胞在保存不良的组织中存活。

在整个人体切片中广泛观察到死细胞上的碎片和抗体的非特异性标记。在成功移植的情况下，细胞变得功能活跃，成熟的神经元显示出重复的，通常是自发的动作电位。快速向内钠、缓慢向外钾流和一定程度的突触活性表明移植物在移植后四周与宿主组织的功能整合。

人体组织离开手术室后处理得越快，系统的可行性和实验程序的成功就越高。