인간 성인 피질의 기관형 배양은 지금까지 인간 이식 된 세포와 인간 숙주 세포 사이의 상호 작용을 연구 할 수있는 손상된 피질에 대한 줄기 세포 치료법을 테스트하는 유일한 시스템입니다. 동물 모델에서 테스트된 치료법은 일반적으로 설치류와 인간 세포의 차이로 인해 임상 환경으로 번역될 때 실패합니다. 여기에서 우리는 인간 대 인간 환경에서 이식된 세포, 생존, 분화 및 기능을 연구할 수 있습니다.
이 방법론은 인간의 뇌에서 신경 회로가 어떻게 작동하는지 이해하는 데 도움이 될 것이며, 또한 뇌 손상 후 기능 회복을 개선하기 위해 이 지식을 임상 환경으로 번역하는 것을 자극할 것입니다. 이 절차를 시연하는 것은 박사 과정 학생 인 Raquel Martinez-Curiel과 석사 과정 학생 인 Costanza Aretio-Medina가 내 연구실에서 나온 것입니다. 시작하려면 통풍이 잘되는 후드 아래 세포 배양 실험실에서 집게를 사용하여 6웰 플레이트에 배양 삽입물을 놓습니다.
멤브레인과 접촉 할 때까지 삽입물 바닥에 5 밀리리터의 인간 성인 피질 배지를 추가합니다. 기포 형성을 피하고 인서트 위에 2 밀리리터의 매체를 추가하십시오. 조직 조각을 삽입물에 옮기기 전에 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소의 인큐베이터에서 최소 2 시간 동안 평형을 이룹니다.
수술실에 있는 환자의 조직을 냉동, 거품 및 분쇄된 절단 용액 용기에 수집합니다. 얼음 위에 놓인 밀폐된 용기를 즉시 실험실의 절단 영역으로 옮깁니다. 조직을 검사하고 피질층의 방향을 고려하여 비브라톰의 절단 단계에 접착할 최적의 표면을 찾습니다.
필요한 경우 메스로 고르지 않은 표면을 잘라 최적의 슬라이스 방향을 위해 스테이지에 티슈를 놓습니다. 그런 다음 조직 접착제로 조직을 무대에 붙입니다. 슬라이싱 챔버에 넣고 즉시 차갑고 거품이 있는 절단 용액으로 채웁니다.
전체 절단 절차 동안 버블링을 계속합니다. 이제 원고에 설명 된대로 조직에서 블레이드까지의 방향에 따라 관상 또는 시상 조각을 자릅니다. 실온에서 버블링 절단 용액이 있는 수집 챔버에 슬라이스를 놓습니다.
모든 조직이 절단되면 슬라이스를 실온에서 헹굼 용액과 함께 멸균 페트리 접시에 옮겨 슬라이스에서 과도한 자당을 제거하고 세포 배양 실험실로 운반합니다. 다음으로, 조직 슬라이스를 습식 및 수중 인서트 위에 개별적으로 놓습니다. 24시간 후, 배지를 교체하여 절단 절차에서 남아 있는 자당 또는 기타 잔류 물질을 제거합니다.
2주 후, 겐타마이신이 없는 인간 성인 피질 배지를 사용한다. 세포 배양 플라스크에서 배지를 제거합니다. 분화 7일째에 500마이크로리터의 트립신을 첨가하여 피질로 프라이밍된 GFP-lt-NES 세포를 분리하고 실온에서 5-10분 동안 배양합니다.
다음으로, 동일한 부피의 트립신 억제제를 첨가 한 다음 5 밀리리터의 DDM 배지를 첨가하십시오. 세포를 다시 현탁하고, 세포 현탁액을 15 밀리리터 튜브로 부드럽게 옮기고, 300 G에서 5 분 동안 원심 분리하고, 인큐베이터에서 후드로 인체 조직이 들어있는 플레이트를 옮기고, 인서트 상단에서 2 밀리리터의 배지를 제거한다. 원심 분리가 끝나면 상층액을 제거하고 차갑고 순수한 기저막 매트릭스에서 세포를 다시 현탁하고 연금을 더 작은 튜브로 옮깁니다.
흡입을 위해 고무 젖꼭지에 연결된 차가운 유리 모세관에 세포 현탁액을 수집합니다. 다양한 부위에 반건조 조직 조각을 찔러 세포 현탁액을 작은 방울로 주입합니다. 젤이 섭씨 37도에서 30분 동안 굳도록 합니다.
그런 다음 인큐베이터에서 후드로 플레이트를 다시 옮기고 인서트 상단에 2 밀리리터의 인간 성인 피질 배지를 조심스럽게 추가하여 조직을 완전히 잠급니다. 급성 인간 성인 피질 조직은 뉴런, 희소돌기아교세포 및 성상교세포의 존재를 나타내어 조직의 최적 보존을 나타냈다. 조직은 세포 배양 2주 후에 뉴런 마커인 NeuN 및 Map2의 발현을 나타내었다.
전체 세포 패치 클램프 기록은 뉴런이 급성 제제의 뉴런에 필적하는 휴지 막 전위와 막 입력 저항을 유지했음을 보여주었습니다. 세포는 신선한 조직보다 약간 덜 활동적이었지만 대부분의 세포는 다중 활동 전위는 아니더라도 적어도 하나를 발사할 수 있었습니다. 급성 피질 조직은 소교세포 마커인 Iba1 및 Tmem119의 발현을 나타내었다.
배양 2주 후, 미세아교세포는 급성 조직보다 덜 파쇄되고 더 활성화된 형태를 획득했습니다. 생체 외 이식 4주 후, 이식된 GFP-lt-NES 세포는 전체 기관형 배양에 걸쳐 광범위하고 복잡한 수목화와 함께 확장된 신경돌기를 나타냈습니다. 이식 된 세포는 잘 보존되지 않은 조직에서 거의 생존하지 못했습니다.
죽은 세포에 대한 항체의 파편 및 비특이적 표지는 인간 조각 전체에서 광범위하게 관찰되었습니다. 성공적인 이식의 경우, 세포는 기능적으로 활성화되었고 성숙한 뉴런은 반복적이고 종종 자발적인 활동 전위를 보였다. 빠른 내부 나트륨, 느린 외부 칼륨 전류 및 특정 수준의 시냅스 활성은 이식 후 4주 후에 이식편과 숙주 조직의 기능적 통합을 나타냅니다.
수술실에서 나온 인체 조직이 더 빨리 처리될수록 시스템의 생존력과 실험 절차의 성공률이 높아집니다.
