Органотипические культуры взрослой коры головного мозга человека до сих пор являются единственной системой для тестирования терапии стволовыми клетками поврежденной коры, которая позволяет изучать взаимодействие между трансплантированными клетками человека и клетками-хозяевами. Терапия, протестированная на животных моделях, обычно терпит неудачу при переводе в клинические условия из-за различий между клетками грызунов и человека. Здесь мы можем изучать трансплантированные клетки, выживание, дифференцировку и функциональность в условиях от человека к человеку.
Эта методология поможет нам понять, как работает нейронная схема в человеческом мозге, а также будет стимулировать перевод этих знаний в клинические условия для улучшения функционального восстановления после повреждения головного мозга. Продемонстрируют процедуру Ракель Мартинес-Куриэль, аспирантка, и Костанца Аретио-Медина, студентка магистратуры, обе из моей лаборатории. Для начала поместите вкладыши культуры в шестилуночную пластину с помощью щипцов в лаборатории клеточных культур под вентилируемым колпаком.
Добавьте пять миллилитров кортикальной среды взрослого человека на дно вкладыша до тех пор, пока он не соприкоснется с мембраной. Избегайте образования пузырьков и добавьте два миллилитра среды поверх вкладыша. Перед тем, как перенести кусочки ткани во вкладыши, уравновесьте их в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение не менее двух часов.
Соберите ткань пациента в операционной в емкость с замороженным, пузырчатым и измельченным режущим раствором. Немедленно перенесите закрытый контейнер на льду в зону резки лаборатории. Осмотрите ткань и, учитывая ориентацию кортикального слоя, найдите лучшую поверхность, чтобы приклеить ее к стадии резки вибратомы.
При необходимости разрежьте неровную поверхность скальпелем, чтобы поместить ткань на сцену для оптимальной ориентации среза. Затем приклейте ткань к сцене тканевым клеем. Поместите его в камеру для нарезки и сразу же залейте холодным пузырчатым режущим раствором.
Продолжайте барботирование в течение всей процедуры резки. Теперь нарежьте корональные или сагиттальные срезы в зависимости от ориентации ткани к лезвию, как описано в рукописи. Поместите срезы в камеру сбора с пузырящимся режущим раствором комнатной температуры.
После того, как вся ткань будет разрезана, переложите срезы в стерильную чашку Петри с раствором для полоскания при комнатной температуре, чтобы удалить излишки сахарозы со срезов и транспортировать их в лабораторию клеточных культур. Затем поместите кусочки ткани по отдельности поверх влажных и погруженных в воду вставок. Через 24 часа смените среду, чтобы удалить оставшуюся сахарозу или другие остаточные вещества из процедуры резки.
Через две недели используйте кортикальную среду взрослого человека без гентамицина. Извлеките носитель из колбы для клеточной культуры. На седьмой день дифференцировки отделяют кортикально праймированные клетки GFP-lt-NES, добавляя 500 микролитров трипсина, и инкубируют в течение 5-10 минут при комнатной температуре.
Затем добавьте равный объем ингибитора трипсина, а затем пять миллилитров среды DDM. Ресуспендируйте клетки, осторожно перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку и центрифугу в течение пяти минут при 300 г. Тем временем перенесите пластину, содержащую человеческую ткань, из инкубатора в капюшон и удалите два миллилитра среды из верхней части вкладыша. В конце центрифугирования удалите надосадочную жидкость, ресуспендируйте клетки в холодной, чистой матрице базальной мембраны и перенесите пенсию в меньшую пробирку.
Соберите клеточную суспензию в холодный стеклянный капилляр, соединенный с резиновой соской для всасывания. Вводите клеточную суспензию в виде крошечных капель, нанося удары по полусухому срезу ткани в различных местах. Дайте гелю застыть при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Затем перенесите пластину из инкубатора обратно в капюшон и осторожно добавьте два миллилитра взрослой корковой среды человека в верхнюю часть вкладыша, чтобы полностью погрузить ткань. Острая корковая ткань взрослого человека показала наличие нейронов, олигодендроцитов и астроцитов, демонстрирующих оптимальную сохранность ткани. Ткань показала экспрессию нейрональных маркеров NeuN и Map2 после двух недель культивирования клеток.
Запись всего клеточного пластыря показала, что нейроны имеют устойчивый мембранный потенциал покоя и сопротивление мембранного входа, сравнимые с нейронами от острых препаратов. Клетки были немного менее активны, чем в свежей ткани, хотя большинство клеток были способны запускать, по крайней мере, один, если не несколько потенциалов действия. Острая корковая ткань показала экспрессию маркеров микроглии Iba1 и Tmem119.
После двух недель в культуре микроглия стала менее разветвленной и приобрела более активированную морфологию, чем в острой ткани. Через четыре недели после трансплантации ex vivo у трансплантированных клеток GFP-lt-NES наблюдались расширенные нейриты с обширными и сложными арборисациями по всей органотипической культуре. В плохо сохранившейся ткани практически не сохранилось ни одной привитой клетки.
Обломки и неспецифическая маркировка антител на мертвых клетках широко наблюдались по всему срезу человека. В случае успешной трансплантации клетки становились функционально активными, а зрелые нейроны проявляли повторяющиеся и часто спонтанные потенциалы действия. Быстрый внутренний натрий, медленные наружу калиевые токи и определенный уровень синаптической активности указывают на функциональную интеграцию трансплантата с тканью хозяина через четыре недели после трансплантации.
Чем быстрее обрабатывается человеческая ткань после того, как она выходит из операционной, тем выше жизнеспособность системы и успех экспериментальной процедуры.
