D环捕获和延伸测定是第一个允许在有丝分裂生长的酵母细胞同源重组期间对D环形成和延伸步骤进行无偏和直接定量的测定。这种与生存能力无关的技术允许研究D环代谢中的蛋白质，否则不可能从以后的角色中解脱出来，只需查看BIR产品。在未来，我们设想将这些检测转移到人类细胞中，以更好地了解关键蛋白质的作用，包括BRCA2以及bloom和Warner kilo病例在同源重组中的作用。
首先将样品离心五分钟。将沉淀重悬于2.5毫升1x补骨脂素溶液中，并将其转移到60×15毫米的培养皿中。对于无交联对照，将沉淀重悬于2.5毫升TE1溶液中。
接下来，将紫外光源设置在轨道振动台中的顶部，设置为 50 RPM。使用带有365纳米长波球的UV交联剂交联样品。将培养皿放置在紫外光源下方一到两厘米处 10 分钟，并在预冷的塑料或有机玻璃板上轻轻摇晃。
然后将样品转移到新的15毫升管中。用2.5毫升TE1溶液冲洗培养皿并将其添加到试管中。将样品离心五分钟。
弃去上清液并将沉淀储存在零下20摄氏度。将样品放在冰上解冻。同时，将干浴预热至30摄氏度。
将样品重悬于一毫升球状喷射缓冲液中，并将其转移到1.5毫升微量离心管中。然后加入3.5微升酶解酶溶液，轻轻搅拌。在 30 摄氏度下孵育 15 分钟。
然后将管子放在冰上。离心三分钟，将样品放在冰上。在一毫升球化缓冲液中洗涤样品三次，并将样品离心三分钟。
将样品重悬于一毫升冷限制性内切酶缓冲液中。离心三分钟，将样品放在冰上。重复洗涤一次。
将样品重悬于一毫升冷的1x限制性内切酶缓冲液中。将样品平均分成两部分。将样品在 16， 000 G 下在 4 摄氏度下离心三分钟。
将每个样品中的一根试管重悬于180微升1.4x限制性内切酶缓冲液中，与杂交寡核苷酸，将另一管重悬于180微升1.4x限制性内切酶缓冲液中，而不杂交寡核苷酸。在液氮中快速冷冻样品。将样品在冰上解冻。
将一个干浴预热至 65 摄氏度，另一个预热至 37 摄氏度。将36微升样品分装到新的微量离心管和4微升1%SDS中，并通过轻轻敲击管的侧面进行混合。在 65 摄氏度下孵育 15 分钟，每五分钟轻轻敲击一次。
孵育后立即将样品放在冰上。加入4.5微升10%Triton X-100，并通过移液混合。向每个样品中添加 20 至 50 单位的高保真 EcoR1 或 HindIII 限制性内切酶。
并在 37 摄氏度下孵育一小时，每 20 到 30 分钟轻轻搅拌一次。在此期间，预热的干浴至55摄氏度，水浴至16摄氏度。向每个样品中加入 8.6 微升 10%SDS，并通过移液和敲击混合。
在 55 摄氏度下孵育 10 分钟。向每个样品中加入 80 微升 10%Triton X-100 并通过移液混合。向每个样品中加入 660 μL 不含 ATP 的 1x 连接缓冲液、pH 8.0 的 1 毫摩尔 ATP 和 8 单位的 T4 DNA 连接酶，并通过倒置轻轻混合。
在 16 摄氏度下孵育 1.5 小时，每 30 分钟倒置一次。孵育后立即将样品放在冰上。按照协议中所述进行DNA纯化后，根据制造商的说明使用两微升纯化的DNA进行20微升的qPCR反应。
对于每个样品，设置五个对照反应和一个定量反应，并一式两份运行。双链断裂或DSB诱导后两小时的DLC测定分析表明，补骨脂素交联至关重要，效率取决于样品采集和qPCR之间的时间。交联样品之间的ARG4 Cp值值相似，但对于没有交联的样品，ARG4 Cp值值较低，因为没有交联的DNA扩增更有效。
对于所有样品，分子间连接qPCR对照均在该范围内。对照组的低qPCR信号证明了DSB诱导的稳健性，该信号在HO核酸内切酶识别位点上扩增。EcoR1 qPCR对照也观察到类似的结果。
通过归一化到分子间连接对照来计算具有杂交寡核苷酸的DLC信号。在DSB诱导后6小时进行的DLE测定分析表明，有和没有杂交寡核苷酸样品之间的ARG4 CP值相似。分子间连接qPCR对照显示，有和没有杂交寡核苷酸样品的信号是可接受的，但失败样品的信号较低。
在所有三个样品中，都有强大的DSB感应。由于HindIII裂解依赖于杂交寡核苷酸的限制性内切酶位点恢复。在切除链的HindIII切割位点的扩增在宽度和无寡核苷酸样品之间存在显着差异。
观察到延伸链上跨位点扩增的差异较小，因为这里的HindIII切割也取决于延伸。样品和缓冲液需要始终保持低温。样品在1.4x冷限制性内切酶缓冲液中重悬后必须快速冷冻，有或没有杂交寡核苷酸。
D环形成和延伸下游对产物形成的影响可以使用南方印迹或遗传终点测定进行研究。可以使用高CP来研究对同源性搜索的影响。染色质免疫沉淀可以提供目标蛋白募集的信息。
