基于AirID的植物蛋白质-蛋白质相互作用的邻近标记

AirID 是蛋白质-蛋白质相互作用的宝贵酶，与其他邻近标记酶相比，它在耗时过程中产生的毒性和错误更少。提出了使用APRR2-AirID蛋白作为模型在黄瓜或黄瓜中进行邻近标记实验AT4G18020分步方案。来自我实验室的 Ahmad Zada、Imran Khan、Yuting Cheng 和 Min Zhang 将演示该程序。

首先将黄瓜或黄瓜种子转移到水中，在 50 摄氏度下孵育 20 分钟，然后将种子放在培养皿上的滤纸上 12 至 16 小时。之后，将种子转移到装有土壤的花盆中，并在 23 摄氏度的气候室中在 16 小时的光照和 18 小时的黑暗光照期内种植三到四个星期。将 2.5 μL 质粒 EarleyGate 100 转移到根癌农杆菌 GV3101 菌株的感受态细胞中。

将试管在冰上孵育 30 分钟，然后将其转移到液氮中 3 分钟。为了给予热冲击，将试管转移到 37 摄氏度的培养箱中五分钟。然后将试管放在冰上两分钟。

向热休克农杆菌细胞中加入 1， 000 微升 Luria Bertani 或 LB 培养基。在30摄氏度和118RPM下孵育细胞一小时后，在4摄氏度下以3000G离心两分钟。然后弃去 800 微升上清液并混合剩余的溶液。

将其铺在补充有每毫升卡那霉素和庆大霉素 50 微克以及每毫升利福平 25 微克的 LB 培养基上。将板在 30 摄氏度下孵育 48 小时。从盘子中捡起一些细菌菌落。

将它们放入补充适当抗生素的LB液体培养基中，并在30摄氏度和218RPM下孵育液体LB36至48小时。在4摄氏度下以3,000G离心两分钟后，将沉淀重悬于农业浸润缓冲液中，以将光密度调节到600纳米波长的1。使用1毫升无针注射器，用1.5毫升重悬的农杆菌接种物浸润背轴表面的整个表皮。

将植物保持在23摄氏度的气候室中，每平方米每秒75微摩尔的光照在黑暗条件下16小时，持续8小时36小时后，将一毫升5微克的生物素渗透到已经过滤过的叶子中。生物素浸润4至12小时后，切下叶子并迅速将其转移到液氮中，以避免蛋白质降解。用研杵和研钵研磨叶子，快速加入两毫升 pH 值为 7.4 的 PBS BSA，然后缓慢研磨。

通过放置在其顶部的快速过滤材料过滤器将样品混合物转移到 15 毫升锥形管中，并将管保持在冰上。将样品转移到两毫升管中。加入 1% 的蛋白质抑制剂混合物，并在离心前通过上下转动试管 7 到 8 次来混合内容物。

完成后，将上清液转移到新的两毫升管中，并加入10%β-D-麦芽糖苷。将试管放在冰上五分钟，然后在 4 摄氏度下以 20， 000 G 离心 10 分钟。为了平衡脱盐柱，标记柱的一侧，并将其离心，标记的一面朝外。

取下色谱柱的顶盖和底盖，再次以1,000G离心，在4摄氏度下离心两分钟。从色谱柱的收集管中弃出液体溶液，并用5毫升PBS缓冲液洗涤管，如前所述，至少五次。在 1.5 毫升管中加入 1 毫升 PBS BSA 到 50 微升链霉亲和素-C1 偶联磁珠中并充分混合。

将试管放在磁性支架上三分钟，以将珠子吸收到试管的一侧。从另一侧丢弃上清液，重复此PBS BSA洗涤三次。为了富集生物素化蛋白质，将两毫升样品加入色谱柱中。

在4摄氏度下以1000G离心柱8分钟后，向50μL链霉亲和素-C1偶联磁珠中加入1毫升脱盐蛋白提取物。将装有磁珠的试管以常速和室温放置在旋转器上30分钟，使溶液充分混合。接下来，将珠子在室温下放在磁架上三分钟，或直到它们聚集在试管的一侧。

轻轻除去上清液，加入一毫升洗涤缓冲液。在旋转器上旋转试管两分钟，并重复在磁架上执行的步骤以除去上清液。同样，如前所述，用一毫升洗涤缓冲液 2 和 3 进行洗涤。

接下来，通过加入1.7毫升50毫摩尔盐酸三盐酸盐并重复在磁架上执行的步骤来去除洗涤缓冲液中的洗涤剂。使用一毫升 50 毫摩尔碳酸氢铵缓冲液洗涤六次，每次洗涤两分钟。完成后，将 50 微升含有 50 毫摩尔盐酸三酯、12% 蔗糖、2% 十二烷基硫酸锂和 1.5% 二硫苏糖醇的蛋白质提取物加入珠子中，并将试管放入 100 摄氏度的培养箱中五分钟以产生热休克。

在磁性架上重复该步骤后，将上清液储存在零下 80 摄氏度以进行 LCMS/MS 分析。提取的蛋白质的蛋白质蛋白质印迹分析显示，浸润的黄瓜叶片中蛋白质表达和生物素化成功。与对照组相比，标记蛋白和额外条带的表达水平更高，证实了AirID成功标记了目标基因的靶蛋白。

使用抗旗和抗质谱抗体确认结果，在所有转化样品中显示靶条带和抗旗抗体。在用链霉亲和素-C1偶联磁珠富集生物素化蛋白后，观察到多种不同大小的蛋白。从所有结果中得出结论，AirID是一种用于分析植物中蛋白质-蛋白质相互作用的新型理想酶。

在邻近标记实验中，重要的是要记住 5 微摩尔生物素和 HR 持续时间是理想的。该协议概述了植物中基于AirID的邻近标记的逐步设置，包括制备叶片样品，去除前生物素，定量提取物蛋白和富集生物素化蛋白。AirID 预计将提高 PPI 独立性生物素化准确性。

综上所述，AirID是植物PPI分析的理想选择。