AirID é uma enzima valiosa para a interação proteína-proteína, e cria menos toxicidade e menos erro em processos demorados do que outras enzimas de marcação de proximidade. Um protocolo passo-a-passo é apresentado para a realização do experimento de marcação de proximidade em pepino ou Cucumis sativus usando AT4G18020 proteína APRR2-AirID como modelo. Demonstrando o procedimento estarão Ahmad Zada, Imran Khan, Yuting Cheng e Min Zhang do meu laboratório.
Comece transferindo as sementes de Cucumis sativus ou pepino em água, incubando-as a 50 graus Celsius por 20 minutos e, em seguida, colocando as sementes no papel de filtro em uma placa de Petri por 12 a 16 horas. Mais tarde, transfira as sementes para vasos contendo solo e cultive-as em uma câmara climática a 23 graus Celsius em 16 horas de luz e 18 horas de escuro por três a quatro semanas. Transferir 2,5 microlitros do plasmídeo EarleyGate 100 para as células competentes da cepa GV3101 da agrobacterium tumefaciens.
Incubar o tubo sobre gelo por 30 minutos antes de transferi-lo para nitrogênio líquido por três minutos. Para dar o choque térmico, transfira o tubo para a incubadora a 37 graus Celsius por cinco minutos. Em seguida, coloque o tubo no gelo por dois minutos.
Adicione 1.000 microlitros de meio Luria Bertani ou LB às células de agrobactéria chocadas pelo calor. Depois de incubar as células a 30 graus Celsius e 118 RPM por uma hora, centrifuga-as a 3000 G por dois minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, descarte o sobrenadante de 800 microlitros e misture a solução restante.
Prato no meio LB suplementado com 50 microgramas por mililitro de canamicina e gentamicina cada e 25 microgramas por mililitro de rifampicina. Incubar as placas a 30 graus Celsius por 48 horas. Pegue algumas colônias bacterianas das placas.
Colocá-los em meio líquido LB, suplementado com antibióticos apropriados e incubar LB líquido a 30 graus Celsius e 218 RPM por 36 a 48 horas. Após dois minutos de centrifugação a 3.000 G a quatro graus Celsius, ressuspenda o pellet em um tampão de agroinfiltração para ajustar a densidade óptica para um no comprimento de onda de 600 nanômetros. Com seringa sem agulha de um mililitro, infiltrar-se em toda a epiderme da superfície abaxial com 1,5 mililitros do inóculo agrobacteriano ressuspenso.
Manter as plantas na câmara climática a 23 graus Celsius com 75 micromoles por metro quadrado por segundo de luz por 16 horas em condições escuras por oito horas Após 36 horas, infiltre um mililitro de cinco microgramas de biotina nas folhas já filtradas. Após quatro a 12 horas de infiltração de biotina, corte as folhas e transfira-as rapidamente para nitrogênio líquido para evitar a degradação proteica. Triture as folhas usando um pilão e argamassa e adicione rapidamente dois mililitros de PBS BSA de pH 7,4, seguido de moagem lenta.
Transfira a mistura de amostras para um tubo cônico de 15 mililitros através de um filtro de material de filtração rápida colocado sobre ele e mantenha o tubo no gelo. Transfira as amostras para um tubo de dois mililitros. Adicione um cocktail inibidor de proteína a 1% e misture o conteúdo virando o tubo para cima e para baixo sete a oito vezes antes de centrifugar.
Uma vez feito, transfira o sobrenadante para um novo tubo de dois mililitros e adicione 10%beta-D-maltosídeo. Coloque o tubo no gelo por cinco minutos antes de centrifugar a 20.000 G por 10 minutos a quatro graus Celsius. Para equilibrar a coluna de dessalinização, marque um lado da coluna e centrifuja-o com o lado marcado voltado para fora.
Retire a tampa superior e inferior da coluna e centrifuja novamente a 1.000 G por dois minutos a quatro graus Celsius. Descarte a solução líquida do tubo coletor da coluna e lave o tubo com cinco mililitros de tampão PBS com centrifugação, como demonstrado anteriormente, pelo menos cinco vezes. Adicione um mililitro de PBS BSA a 50 microlitros de esferas magnéticas conjugadas com Streptavidina-C1 em um tubo de 1,5 mililitro e misture completamente.
Coloque o tubo em um suporte magnético por três minutos para absorver as contas em direção a um lado do tubo. Descarte o sobrenadante do outro lado e repita esta lavagem PBS BSA três vezes. Para enriquecer a proteína biotinilada, adicione dois mililitros das amostras à coluna.
Após centrifugação da coluna a 1000 G por oito minutos a quatro graus Celsius, adicionar um mililitro de extrato proteico dessalgado a 50 microlitros de esferas magnéticas conjugadas com Streptavidina-C1. Misture bem a solução colocando o tubo contendo esferas magnéticas no rotador à velocidade normal e à temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida, coloque as contas no rack magnético por três minutos em temperatura ambiente ou até que se juntem em um dos lados do tubo.
Retire suavemente o sobrenadante e adicione um mililitro de tampão de lavagem. Gire o tubo por dois minutos em um rotador e repita o passo realizado no rack magnético para remover o sobrenadante. Da mesma forma, realizar as lavagens com um mililitro dos tampões de lavagem dois e três, conforme demonstrado anteriormente.
Em seguida, remova o detergente nos tampões de lavagem adicionando 1,7 mililitros de cloridrato de tris 50 milimolares e repetindo a etapa realizada no rack magnético. Faça seis lavagens de dois minutos cada usando um mililitro de tampão bicarbonato de amônio 50 milimolar. Uma vez feito, adicione 50 microlitros do extrato proteico contendo 50 milimolares de cloridrato de tris, 12% de sacarose, 2% de lauril sulfato de lítio e 1,5% de ditiotreitol às esferas e coloque o tubo na incubadora a 100 graus Celsius por cinco minutos para dar choque térmico.
Depois de repetir o passo em um rack magnético, armazene o sobrenadante a 80 graus Celsius negativos para análise LCMS/MS. A análise por western blot das proteínas extraídas mostrou sucesso na expressão e biotinilação proteica nas folhas de pepino infiltradas. O maior nível de expressão de proteínas marcadas e bandas extras em comparação com o controle confirmou o sucesso na marcação das proteínas-alvo do gene de interesse pelo AirID.
Os resultados foram confirmados usando anticorpos Anti-Flag e Anti-Mass mostrando a banda-alvo com um anticorpo Anti-Flag em todas as amostras transformadas. Após o enriquecimento de proteínas biotiniladas com esferas magnéticas conjugadas com Streptavidina-C1, múltiplas proteínas de diferentes tamanhos foram observadas. A partir de todos os resultados, concluiu-se que AirID é uma enzima nova e ideal para analisar interações proteína-proteína em plantas.
Durante o experimento de marcação por proximidade, é importante lembrar que cinco micromolares de biotina e duração da FC são ideais. O protocolo descreve o passo a passo da marcação por proximidade baseada em AirID na planta, incluindo a preparação da amostra de folha, remoção da pré-biotina, quantificação da proteína do extrato e enriquecimento de proteínas biotiniladas. O AirID é projetado para melhorar a precisão da biotinilação independente de PPI em combinação.
Conclui-se que o AirID é ideal para análise de IBP em plantas.
