AirID هو إنزيم قيم للتفاعل بين البروتين والبروتين ، ويخلق سمية أقل وخطأ أقل في العمليات التي تستغرق وقتا طويلا من إنزيمات وضع العلامات القريبة الأخرى. يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة لإجراء تجربة وضع العلامات القريبة في الخيار أو Cucumis sativus باستخدام بروتين APRR2-AirID AT4G18020 كنموذج. سيوضح الإجراء أحمد زادة وعمران خان ويوتينغ تشنغ ومين تشانغ من مختبري.
ابدأ بنقل بذور Cucumis sativus أو الخيار في الماء ، واحتضانها عند 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، ثم وضع البذور على ورق الترشيح على طبق بتري لمدة 12 إلى 16 ساعة. في وقت لاحق ، انقل البذور إلى الأواني التي تحتوي على التربة وقم بزراعتها في غرفة مناخية عند 23 درجة مئوية في 16 ساعة من الضوء و 18 ساعة من فترة الصور المظلمة لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع. نقل 2.5 ميكرولتر من البلازميد EarleyGate 100 إلى الخلايا المختصة من سلالة agrobacterium tumefaciens GV3101.
احتضان الأنبوب على الجليد لمدة 30 دقيقة قبل نقله إلى النيتروجين السائل لمدة ثلاث دقائق. لإعطاء الصدمة الحرارية ، انقل الأنبوب إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. ثم ضع الأنبوب على الثلج لمدة دقيقتين.
أضف 1،000 ميكرولتر من لوريا بيرتاني أو LB المتوسطة إلى خلايا البكتيريا الزراعية المصدومة بالحرارة. بعد احتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية و 118 دورة في الدقيقة لمدة ساعة واحدة ، قم بطردها عند 3000 جرام لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. ثم تخلص من المادة الطافية سعة 800 ميكرولتر واخلط المحلول المتبقي.
ضعه على وسط LB مع 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من الكانامايسين والجنتاميسين لكل منهما و 25 ميكروغرام لكل ملليلتر من ريفامبيسين. احتضان لوحات في 30 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. التقط بعض المستعمرات البكتيرية من اللوحات.
ضعها في وسائط سائلة LB ، مع استكمالها بالمضادات الحيوية المناسبة واحتضان LB السائل عند 30 درجة مئوية و 218 دورة في الدقيقة لمدة 36 إلى 48 ساعة. بعد دقيقتين من الطرد المركزي عند 3،000 G عند أربع درجات مئوية ، أعد تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت للتسلل الزراعي لضبط الكثافة الضوئية إلى واحدة عند الطول الموجي 600 نانومتر. باستخدام حقنة عديمة الإبر ملليلتر واحد ، تسلل إلى كامل البشرة من سطح المحور مع 1.5 ملليلتر من اللقاح الزراعي البكتيري المعاد تعليقه.
الحفاظ على النباتات في غرفة المناخ عند 23 درجة مئوية مع 75 ميكرومول لكل متر مربع في الثانية الخفيفة لمدة 16 ساعة في ظروف مظلمة لمدة ثماني ساعات بعد 36 ساعة ، تسلل ملليلتر واحد من خمسة ميكروغرام من البيوتين إلى الأوراق المفلترة بالفعل. بعد أربع إلى 12 ساعة من تسلل البيوتين ، قم بقطع الأوراق ونقلها بسرعة إلى النيتروجين السائل لتجنب تدهور البروتين. طحن الأوراق باستخدام مدقة وقذائف الهاون وإضافة بسرعة ملليلتر من PBS BSA من درجة الحموضة 7.4 ، تليها طحن بطيء.
انقل مزيج العينة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر من خلال مرشح مادة ترشيح سريع يوضع فوقه واحتفظ بالأنبوب على الجليد. نقل العينات إلى أنبوب 2 ملليلتر. أضف كوكتيلا مثبطا للبروتين بنسبة 1٪ واخلط المحتويات عن طريق قلب الأنبوب لأعلى ولأسفل سبع إلى ثماني مرات قبل الطرد المركزي.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 2 ملليلتر وأضف 10٪ بيتا-د-مالتوسيد. ضع الأنبوب على الثلج لمدة خمس دقائق قبل الطرد المركزي عند 20،000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. لموازنة العمود المحلى ، ضع علامة على جانب واحد من العمود وطرده مركزيا بحيث يكون الجانب المحدد متجها للخارج.
قم بإزالة الغطاء العلوي والسفلي للعمود وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 1،000 جم لمدة دقيقتين عند أربع درجات مئوية. تخلص من المحلول السائل من أنبوب التجميع في العمود واغسل الأنبوب بخمسة ملليلتر من المخزن المؤقت PBS مع الطرد المركزي كما هو موضح سابقا ، خمس مرات على الأقل. أضف ملليلتر واحد من PBS BSA إلى 50 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المترافقة Streptavidin-C1 في أنبوب سعة 1.5 ملليلتر واخلطها جيدا.
ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي لمدة ثلاث دقائق لامتصاص الخرزات باتجاه جانب واحد من الأنبوب. تخلص من المادة الطافية من الجانب الآخر وكرر غسل PBS BSA ثلاث مرات. لإثراء البروتين الحيوي ، أضف ملليلتر من العينات إلى العمود.
بعد الطرد المركزي للعمود عند 1000 غرام لمدة ثماني دقائق عند أربع درجات مئوية ، أضف ملليلتر واحد من مستخلص البروتين المحلى إلى 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المترافق Streptavidin-C1. امزج المحلول جيدا عن طريق وضع الأنبوب الذي يحتوي على حبات مغناطيسية على الدوار بالسرعة العادية ودرجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، ضع الخرزات على الرف المغناطيسي لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة أو حتى تتجمع على جانب واحد من الأنبوب.
قم بإزالة المادة الطافية برفق وأضف ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للغسيل. قم بتدوير الأنبوب لمدة دقيقتين على المدور وكرر الخطوة التي تم إجراؤها على الرف المغناطيسي لإزالة المادة الطافية. وبالمثل ، قم بإجراء الغسيل باستخدام ملليلتر واحد من مخازن الغسيل الثانية والثالثة كما هو موضح سابقا.
بعد ذلك ، قم بإزالة المنظف في مخازن الغسيل عن طريق إضافة 1.7 ملليلتر من 50 مليمول تريس هيدروكلوريد وتكرار الخطوة التي يتم إجراؤها على الرف المغناطيسي. أعط ست غسلات مدة كل منها دقيقتان باستخدام ملليلتر واحد من 50 ملليمول من بيكربونات الأمونيوم. بمجرد الانتهاء من ذلك ، أضف 50 ميكرولترا من مستخلص البروتين الذي يحتوي على 50 مليمولار تريس هيدروكلوريد ، و 12٪ سكروز ، و 2٪ كبريتات لوريل ليثيوم ، و 1.5٪ ديثيوثريتول إلى الخرز ، وضع الأنبوب في الحاضنة عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق لإحداث صدمة حرارية.
بعد تكرار الخطوة على رف مغناطيسي ، قم بتخزين المادة الطافية عند درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر لتحليل LCMS / MS. أظهر تحليل اللطخة الغربية للبروتينات المستخرجة تعبيرا ناجحا للبروتين والبيوتينيل في أوراق الخيار المتسللة. أكد مستوى التعبير الأعلى للبروتينات الموسومة والنطاقات الإضافية مقارنة بالمجموعة الضابطة نجاح وضع العلامات على البروتينات المستهدفة للجين محل الاهتمام بواسطة AirID.
تم تأكيد النتائج باستخدام الأجسام المضادة المضادة للعلم والكتلة التي تظهر النطاق المستهدف بجسم مضاد للعلم في جميع العينات المحولة. بعد إثراء البروتينات البيوتينيلاتية بالخرز المغناطيسي المترافق Streptavidin-C1 ، لوحظت بروتينات متعددة بأحجام مختلفة. من جميع النتائج ، استنتج أن AirID هو إنزيم جديد ومثالي لتحليل تفاعلات البروتين والبروتين في النباتات.
أثناء تجربة وضع العلامات على القرب ، من المهم أن تتذكر أن خمسة ميكرومولار بيوتين ومدة HR مثالية. يحدد البروتوكول الإعداد خطوة بخطوة لوضع العلامات على القرب القائم على AirID في النبات ، بما في ذلك تحضير عينة الأوراق ، وإزالة ما قبل البيوتين ، وتحديد كمية بروتين المستخلص ، وإثراء البروتينات البيوتينيل. من المتوقع أن يحسن AirID دقة البيوتينيل المستقلة ل PPI معا.
وخلص إلى أن AirID مثالي لتحليل PPI في النباتات.
