细胞培养是在受控实验室环境中培养各种类型的细胞和组织所必需的精细技能。进行细胞培养工作时的主要问题是污染。这种污染可能以细菌、霉菌或支原体的形式出现。
本视频中概述的所有技术和实践将确保您的细胞保持活力、健康和无污染。应严格遵守这些做法，所有实验室人员应每年至少接受一次培训。在开始工作之前，请穿上仅在细胞培养室使用的干净实验室外套。
戴上未接触任何其他表面的新手套。确保手套紧贴。丁腈无粉手套是最好的。
实验室外套和手套不需要无菌。为了准备工作，用70%乙醇喷洒手套，实验室衣套和生物安全柜的内部。从内部和外部喷洒工作表面、侧面、背面、机柜中的任何物品和前玻璃面板。
用不起毛的纸巾擦干工作表面和玻璃面板。花一些时间安排机柜内的工作空间。将水浴放在细胞培养室内，并仅将其用于细胞培养目的，例如加热培养基或解冻细胞。
水浴应每周排干和清洗一次。限制带入机柜的物品数量，不要通过阻塞前格栅或后格栅来中断生物安全柜内的气流。用70%乙醇喷洒橱柜内的所有物品并擦干。
首先喷洒培养基瓶的顶部，然后向下喷洒。用干净的纸巾，从培养基瓶的顶部开始擦干，逐渐向下。不要朝盖子走回去。
这些机柜的工作方式是它们通过前后格栅从房间和机柜本身抽取空气。空气流向机柜的背面并到达顶部。在那里，受污染的空气通过成堆的过滤器，部分过滤后的清洁空气被推到机柜的工作区域。
如果柜子足够大，可以容纳血清移液器，则可以将它们放在里面，否则，它们可以存放在安装在柜子外部的容器中。使用前最好检查包装中的移液器两侧是否有孔洞、撕裂或穿孔。不要撕掉包装。
相反，轻轻剥开包装的末端。将血清移液器插入移液器辅助设备，并以一个流体动作取下包装。不要将鼠标悬停在任何打开的瓶子或烧瓶上。
不建议将手伸过打开的瓶子或烧瓶，或在打开的烧瓶上方工作。机柜内的气流压在里面的任何东西上。伸手过去可以让您的袖子或手套放在物品上，这可能会将袖子上存在的任何污染物推到细胞培养物中。
尽可能不要倒入液体。相反，使用血清移液器添加它们。彻底混合内容物并初始化瓶子。
写下媒体的补充内容。如果您正在使用贴壁培养物并且需要一个塑料烧瓶，请喷洒整个包装并将其放入内部。每当你的手套干涸时，再次用乙醇喷洒它们。
使用贴壁细胞系时，使用高压灭菌玻璃移液器或一次性无菌塑料移液器吸出培养基或洗涤溶液。小心地从存储容器中取下金属盖。通过以一定角度轻轻摇晃容器来隔离一个玻璃移液器。
将手伸入容器时，避免触摸任何其他移液器。仅从一端处理所选移液器。尽快快速更换瓶子和烧瓶上的盖子。
将盖子倒置放在工作台面上，使轮辋不会接触工作台面。不要从顶部或底部抓住盖子。相反，请从侧面触摸盖子。
吸入液体时，请使用位于机柜外的真空捕集瓶，放在地板上的辅助容器中。在机柜内工作时会产生废物。由于经常将手移入和移出机柜会中断气流，因此可以暂时将任何废物留在机柜内。
将其放在一边，这样它就不会中断您的工作。每当手套变干时，请大量喷洒70%乙醇。揉搓双手，以免它们滴湿。
关于血清移液器的快速说明。如果他们不小心碰到了引擎盖中的其他东西，请不要犹豫，把它们扔掉。最好从干净的血清移液管重新开始，而不是使用可能被污染的移液器。
在将细胞放入培养箱之前，请检查它们在显微镜下的外观。应观察单细胞。这表明细胞已被彻底重悬。
不要说话、打喷嚏、咳嗽或对着培养箱重呼吸。快速打开和关闭培养箱门。让它们打开的时间超过必要的时间可能会使空气中存在的污染物进入培养箱。
确保所有瓶子上的盖子都完全关闭，然后再将它们从柜子中取出。介质对光敏感。不使用时应存放在四摄氏度的黑暗中。
细胞培养工作完成后，再次用70%乙醇喷洒柜子内部，并用纸巾擦干表面。清空生物危害废物袋。重复此过程，并在切换到其他细胞系时更换手套。
使用在玻璃烧瓶中生长的悬浮培养物时，请确保手套是湿的。用湿手套触摸铝箔，然后只喷洒烧瓶的底部，然后再将其放入生物安全柜。取样进行细胞计数时，仅从容器中取出一个 1.5 ml 管。
请勿触摸任何其他管子。将盖子倒置放在工作表面上。请勿触摸内缘。
从侧面小心处理它，完成后更换它。处理悬浮细胞和玻璃烧瓶时，请小心地取下覆盖烧瓶整个颈部的双折叠铝箔。轻轻拉动所有四个角，然后将箔纸倒置放在工作表面上。
仅从底部处理玻璃烧瓶。箔片脱落后，请勿从脖子上触摸它。使用1ml血清移液管取样进行细胞计数。
不要让培养基从烧瓶侧面滴落。如果是这样，请用70%乙醇喷洒纸巾并立即清理。在从生物安全柜中取出瓶子或烧瓶之前，确保盖子或铝箔已拧紧。
对不同的细胞类型使用单独的培养箱。这将防止不同细胞类型的交叉污染。建议将用于收集液体废物的真空捕集瓶放置在地板上的柜外的次要容器中，标记为废物。
软管连接到每月更换一次的过滤器。软管从机柜侧面进入。工作完成后，清除生物危害垃圾。
在水槽旁的墙上保留玻璃清洗方案。首先，用10%漂白剂浸泡丢弃的细胞约五分钟。然后丢弃漂白剂混合物并用水彻底冲洗烧瓶。
用水加入肥皂，用刷子擦洗干净，用更多的水冲洗。然后最后一步是用右侧水龙头上的去离子水冲洗玻璃器皿。尽快清洗玻璃烧瓶，将玻璃器皿擦洗干净。
如果Sf9细胞没有正确擦洗，它会离开这个死细胞边缘。这些烧瓶仅用于细胞培养，高压灭菌细胞培养玻璃器皿，而不是将其送到玻璃洗涤设施。在高压釜上使用真空循环40分钟灭菌时间和40分钟干燥时间。
将其与实验室主要区域的玻璃器皿分开。组织细胞培养室，使所有耗材都位于一个区域，从而最大限度地减少实验室成员离开细胞培养室寻找耗材的需要。标记任何用于收获细胞并在之后在细胞培养中重复使用的塑料瓶，仅供细胞培养使用。
将指定的细胞培养瓶用于一种特定的细胞类型。将这些瓶子存放在细胞培养室中，以便于取用。对于悬浮生长的培养物，霉菌将在培养基中被识别为漂浮的球。
至于细菌污染，它会使介质变白和浑浊。同样，对于贴壁细胞，霉菌污染可以很容易地识别为模糊斑块。细菌污染会变成正常透明的介质，白色和浑浊。
许多种类的支原体可以通过基于PCR的测定法可靠地鉴定。左边的条带显示了DNA的分子量标准品。右边的四个波段是阳性对照。
在测试细胞类型下没有出现条带，因为未检测到支原体。如果存在pH指示剂，细胞培养基的颜色将从红色变为黄色。黄色表示pH值低，应更换培养基。
如果在进行细胞计数时在光学显微镜下观察到其他生长或细胞形状，那么这可能是污染的指标。请注意，在细胞计数之前应彻底清洁血细胞计数器，因为这种类型的碎片可能仅存在于血细胞计数器上，而不存在于细胞培养物本身中。虽然污染是进行细胞培养工作时的主要问题之一，但通过遵循本视频中概述的实践和技术可以减轻这些风险。
如果每月进行每月一次支原体检测，实验室人员每年接受培训并严格遵守这些做法，那么您的细胞将保持健康且无污染。这也将有助于降低与购买昂贵的细胞培养基、购买新细胞相关的成本，并将减少培养箱去污停机时间。请记住，成功细胞培养的关键是及早采取行动，以便首先防止污染。
