El cultivo celular es una habilidad delicada necesaria para cultivar varios tipos de células y tejidos en un entorno de laboratorio controlado. La principal preocupación al realizar trabajos de cultivo celular es la contaminación. Esta contaminación puede venir en forma de bacterias, moho o micoplasma.
Las técnicas y prácticas descritas en este video asegurarán que sus células permanezcan viables, sanas y libres de contaminación. Estas prácticas deben cumplirse estrictamente, y todo el personal de laboratorio debe recibir capacitación al menos una vez al año. Antes de comenzar a trabajar, use una bata de laboratorio limpia designada para su uso solo en la sala de cultivo celular.
Use guantes nuevos que no hayan tocado ninguna otra superficie. Asegúrese de que los guantes queden bien. Los guantes sin polvo de nitrilo son los mejores.
La bata de laboratorio y los guantes no necesitan ser estériles. Para prepararse para el trabajo, rocíe guantes, mangas de bata de laboratorio y el interior del gabinete de seguridad biológica con 70% de etanol. Rocíe la superficie de trabajo, los lados, la parte posterior, cualquier elemento en el gabinete y el panel de vidrio frontal, tanto desde el interior como desde el exterior.
Limpie la superficie de trabajo y el panel de vidrio con una toalla de papel sin pelusa. Tómese un tiempo para organizar el espacio de trabajo dentro del gabinete. Mantenga baños de agua dentro de la sala de cultivo celular y solo utilícelos para fines de cultivo celular, como calentar medios o descongelar células.
Los baños de agua deben drenarse y lavarse una vez a la semana. Limite la cantidad de artículos introducidos en el gabinete y no interrumpa el flujo de aire dentro del gabinete de seguridad biológica bloqueando las rejillas delanteras o traseras. Rocíe todos los artículos colocados dentro del gabinete con etanol al 70% y límpielos en seco.
Comience rociando la parte superior de la botella de medios y vaya hacia abajo. Con una toalla de papel limpia, comience desde la parte superior de la botella de medios para secarla, avanzando progresivamente hasta la parte inferior. No vuelva a subir hacia la tapa.
La forma en que funcionan estos gabinetes es que extraen aire de la habitación y del gabinete a través de las rejillas delanteras y traseras. El aire va hacia la parte posterior del gabinete y sube hasta la parte superior. Allí, el aire contaminado pasa a través de un montón de filtros, y parte del aire limpio filtrado es empujado hacia abajo sobre el área de trabajo en el gabinete.
Si el gabinete es lo suficientemente grande como para acomodar pipetas serológicas, se pueden colocar en el interior, de lo contrario, se pueden almacenar en un recipiente montado en el exterior del gabinete. Es una buena práctica revisar cualquiera de los lados de la pipeta encapsulada en busca de agujeros, rasgaduras o pinchazos en el envase antes de su uso. No arranque el envoltorio.
En su lugar, pelar suavemente los extremos de la envoltura. Inserte la pipeta serológica en una ayuda de pipeta y retire la envoltura con un movimiento fluido. No pase el cursor sobre botellas o frascos abiertos.
No se recomienda alcanzar una botella o matraz abierto, o trabajar por encima de los matraces abiertos. El flujo de aire dentro de los gabinetes empuja hacia abajo cualquier cosa en el interior. Estirar la mano permitirá que su manga o guante esté encima de los elementos que podrían empujar hacia abajo cualquier contaminación presente en su manga, por ejemplo, en su cultivo celular.
Siempre que sea posible, no vierta líquidos. En su lugar, añádalos con una pipeta serológica. Mezcle bien el contenido e inicialice la botella.
Escriba con qué se complementan los medios. Si está trabajando con cultivos adherentes y necesita un matraz de plástico, rocíe todo el paquete y colóquelo dentro. Cada vez que sus guantes se hayan secado, rocíelos con el etanol nuevamente.
Cuando trabaje con una línea celular adherente, use pipetas de vidrio esterilizadas en autoclave o pipetas de plástico estériles desechables para aspirar medios o soluciones de lavado. Retire con cuidado la tapa metálica del recipiente de almacenamiento. Aísle una pipeta de vidrio agitando suavemente el recipiente en ángulo.
Al meter la mano en el recipiente, evite tocar cualquier otra pipeta. Manipule la pipeta elegida desde un solo extremo. Reemplace rápidamente las tapas de botellas y frascos tan pronto como sea posible.
Coloque las tapas en la superficie de trabajo boca abajo para que la llanta no toque la superficie de trabajo. No agarre la tapa desde la parte superior o inferior. En su lugar, toque las tapas desde los lados.
Al aspirar líquidos, utilice un matraz de vacío situado fuera del armario en un recipiente secundario en el suelo. Los residuos se crearán mientras se trabaja dentro del gabinete. Debido a que mover las manos dentro y fuera del gabinete con demasiada frecuencia interrumpirá el flujo de aire, está bien dejar temporalmente cualquier desperdicio dentro del gabinete.
Colóquelo a un lado para que no interrumpa su trabajo. Rocíe generosamente los guantes con etanol al 70% cada vez que se sequen. Frota tus manos para que no se mojen.
Una nota rápida sobre las pipetas serológicas. Si accidentalmente tocan algo más en la capucha, no dude en tirarlos. Es mejor comenzar de nuevo con una pipeta serológica limpia en lugar de usar una que pueda estar contaminada.
Antes de colocar células en la incubadora, verifique cómo se ven bajo el microscopio. Se deben observar células individuales. Esto indica que las células han sido resuspendidas completamente.
No hable, estornude, tosa ni respire pesadamente en las incubadoras. Abra y cierre rápidamente las puertas de la incubadora. Dejarlos abiertos durante más tiempo del necesario puede permitir que los contaminantes presentes en el aire entren en las incubadoras.
Asegúrese de que las tapas de todas las botellas estén bien cerradas antes de sacarlas del gabinete. Los medios son sensibles a la luz. Debe almacenarse en la oscuridad a cuatro grados centígrados cuando no esté en uso.
Rocíe el interior del gabinete con etanol al 70% nuevamente después de que se complete el trabajo de cultivo celular y seque la superficie con una toalla de papel. Vacíe la bolsa de residuos de riesgo biológico. Repita este proceso y reemplace los guantes cuando cambie a una línea celular diferente.
Cuando trabaje con cultivos en suspensión cultivados en frascos de vidrio, asegúrese de que los guantes estén mojados. Toque el papel de aluminio con sus guantes mojados y luego rocíe solo la parte inferior del matraz antes de colocarlo dentro del gabinete de seguridad biológica. Cuando tome una muestra para el recuento celular, retire solo un tubo de 1,5 ml de su recipiente.
No toque ninguno de los otros tubos. Coloque la tapa boca abajo sobre la superficie de trabajo. No toque el borde interior.
Manéjelo con cuidado desde los lados y reemplácelo una vez que haya terminado. Cuando manipule celdas de suspensión y matraces de vidrio, retire con cuidado la pieza doble doblada de papel de aluminio que cubre todo el cuello del matraz. Tire suavemente de las cuatro esquinas y coloque la lámina boca abajo sobre la superficie de trabajo.
Manipule el matraz de vidrio únicamente desde la parte inferior. No lo toque desde el cuello una vez que la lámina esté fuera. Utilice una pipeta serológica de 1 ml para tomar una muestra para el recuento celular.
No deje que los medios goteen por el costado de los frascos. Si lo hace, rocíe una toalla de papel con 70% de etanol y límpiela de inmediato. Asegúrese de que las tapas o el papel de aluminio estén apretados antes de retirar las botellas o frascos de los gabinetes de seguridad biológica.
Utilice incubadoras separadas para diferentes tipos de células. Esto evitará la contaminación cruzada de diferentes tipos de células. Se recomienda colocar el matraz trampa de vacío para recoger los residuos líquidos fuera del armario en el suelo en un recipiente secundario etiquetado como residuos.
La manguera está conectada a un filtro que se reemplaza mensualmente. La manguera entra por el costado del gabinete. Retire la basura de riesgo biológico una vez que se complete el trabajo.
Mantenga un protocolo de lavado de vidrio en la pared junto al fregadero. Primero, remoje las células desechadas con blanqueador al 10% durante unos cinco minutos. A continuación, deseche la mezcla de lejía y enjuague bien el matraz con agua.
Agregue jabón con agua, frótelo con un cepillo muy bien, enjuague con más agua. Y luego el paso final es enjuagar la cristalería con el agua DI en el grifo a la derecha. Lave los frascos de vidrio lo antes posible, frote bien la cristalería.
Las células Sf9 dejarán este borde de células muertas si no se limpia adecuadamente. Utilice estos frascos solo para cultivo celular, cristalería de cultivo celular en autoclave en lugar de enviarlos a una instalación de lavado de vidrio. Utilice el ciclo de vacío en el autoclave durante 40 minutos de tiempo esterilizado y 40 minutos de tiempo de secado.
Manténgalo separado de la cristalería en el área principal del laboratorio. Organice la sala de cultivo celular para que todos los suministros estén ubicados en un área, minimizando así la necesidad de que los miembros del laboratorio salgan de la sala de cultivo celular en busca de suministros. Etiquete cualquier botella de plástico utilizada para cosechar células y reutilizada en cultivo celular después, solo para uso de cultivo celular.
Utilice los frascos de cultivo celular designados para un tipo de célula específico. Guarde estos frascos en la sala de cultivo celular para facilitar el acceso. Para los cultivos que se cultivan en suspensión, el moho será reconocido como bolas flotantes en los medios.
En cuanto a la contaminación bacteriana, se volverá blanco y turbio el medio. Del mismo modo, para las células adherentes, la contaminación por moho se puede reconocer fácilmente como parches difusos. La contaminación bacteriana se volverá normalmente un medio transparente, blanco y turbio.
Muchas especies de micoplasma se pueden identificar de forma fiable mediante un ensayo basado en PCR. La banda de la izquierda muestra los estándares de peso molecular para el ADN. Las cuatro bandas de la derecha son controles positivos.
No aparecen bandas bajo los tipos de células probadas porque no se detectó micoplasma. Los medios de cultivo celular cambiarán de color de rojo a amarillo si hay indicadores de pH presentes. El color amarillo indica que el pH es bajo y el medio debe ser reemplazado.
Si se observan otros crecimientos o formas celulares bajo el microscopio óptico mientras se realizan recuentos celulares, entonces esto puede ser un indicador de contaminación. Tenga en cuenta que se debe realizar una limpieza completa del hemocitómetro antes del recuento celular, ya que este tipo de desechos puede estar presente solo en el hemocitómetro y no en el cultivo celular en sí. Si bien la contaminación es una de las principales preocupaciones al realizar trabajos de cultivo celular, estos riesgos pueden mitigarse siguiendo las prácticas y técnicas descritas en este video.
Si se realiza una prueba mensual de micoplasma cada mes, el personal de laboratorio recibe capacitación anual y estas prácticas se cumplen estrictamente, entonces sus células permanecerán sanas y libres de contaminación. Esto también ayudará a reducir los costos asociados con la compra de costosos medios de cultivo celular, la compra de nuevas células y reducirá el tiempo de inactividad de la descontaminación de la incubadora. Recuerde, la clave para un cultivo celular exitoso es la acción temprana para prevenir la contaminación en primer lugar.
