冷冻保存的上皮隐窝仔猪肠道3D类器官的培养和细胞单层的建立

我们的协议为兽医和生物医学研究提供了研究猪肠上皮的工具。猪的肠道类器官可用于研究营养转运、屏障功能和宿主-微生物相互作用。通过保存猪肠上皮隐窝可以产生大量的干细胞，以后可用于培养3D或2D单层类器官。

该方案针对空肠有详细说明，但也可用于其他肠道段，例如十二指肠、回肠和结肠。首先，在37摄氏度的水浴中快速解冻装有900个冷冻地穴的小瓶。将隐窝溶液转移到15毫升锥形管中。

在室温下以300×g离心五分钟，除去上清液。用冷却的尖端加入150微升细胞外基质或ECM，以获得每25微升ECM150个隐窝的最终浓度。上下移液 10 次，以获得 ECM 中隐窝的均匀悬浮液。

在预热的48孔板中以每孔25微升的滴液滴播种六个孔。在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育30分钟以聚合ECM。在室温下每孔加入250微升培养基，并在37摄氏度和5%二氧化碳下孵育。

每两到三天更换一次培养基。为了在接种后10天传代来自冷冻隐窝的3D类器官，请去除培养基并在37摄氏度下加入250微升预热的PBS。孵育后，用250微升预热的酶解离试剂替换PBS，并在每孔中补充10微摩尔岩石抑制剂，每孔37摄氏度。

用P-1000移液器刮取ECM中的类器官，并通过移液五次仔细均质。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 5 分钟，然后通过上下移液 10 次解离细胞。在含有解离细胞的每个孔中加入 500 微升 DMEMc，并在含有 3 毫升冷 DMEMc 的 15 毫升锥形管中拉出多达 12 个孔。

在 500 x g 下在 4 摄氏度下离心五分钟。弃去上清液并将沉淀重悬于一毫升冷DMEMc中。用细胞计数器在台盼蓝中稀释一到两个细胞。

离心所需体积的细胞溶液，使每个圆顶有3000个活细胞。在冰上每3000个活细胞用17微升冷DMEMc重悬沉淀。将体积调整到所需的孔数。

每3000个活细胞缓慢添加33微升冷ECM。将体积调整到所需的孔数并均质化而不会产生气泡。然后在预热的24孔板中查看每孔50微升ECM细胞悬液的孔，并孵育30分钟以聚合ECM。

每孔加入500微升培养基。然后每两到三天孵育并更换培养基。为了涂覆培养物，制备含有胶原蛋白IV的涂层溶液，在冷PBS中以每毫升50微克稀释。

向每个细胞培养插入物中加入150微升稀释的包衣溶液，孵育过夜或三小时。分裂五天后，用 P-1000 移液器刮取类器官，用 ECM 分离类器官。通过在培养基中移液小心均质，并转移到含有5毫升冷DMEMc的15毫升锥形管中。

将收集的类器官在 500 x g 下在 4 摄氏度下离心五分钟。小心吸出上清液并将细胞沉淀重悬于一毫升补充有10微摩尔ROCK抑制剂的预热酶解离试剂中。上下移液10次以启动类器官的解离。

在 37 摄氏度的水浴中孵育五分钟以进行酶消化。通过移液 10 次机械破坏类器官，并加入 4 毫升冰冷的 DMEMc。离心并丢弃上清液，然后将类器官细胞沉淀重悬于一毫升DMEMc中。

用细胞计数器计数台盼蓝中的细胞，并计算所需的体积，以接种2.5乘以10到每个培养插入的第五个细胞。离心所需体积的细胞悬液，相当于每个培养插入物的10个第五个细胞的2.5倍。在离心过程中，小心地从培养物中吸出包衣溶液，并在没有盖子的情况下在引擎盖下干燥五分钟。

离心后，弃去上清液并将沉淀重悬于补充有10微摩尔ROCK抑制剂的必要体积的2D培养基中。将200微升细胞悬液接种到包被的透膜上。将 500 μL 补充有 10 μmolar ROCK 抑制剂的 2D 培养基加入下部隔室并孵育。

应在膜上观察到高密度的细胞。接种一天后，用不含 ROCK 抑制剂的新鲜 2D 培养基替换史诗和基础培养基。每天更换媒体。

单层在播种后一天会汇合，可用于其实验。本研究从猪肠获得上皮隐窝，冷冻保存于液氮中长期储存。解冻后，将隐窝干细胞接种在ECM中。

在三到四天内观察到类器官，并迅速生长和发展出芽结构。解冻后约10天，进行类器官传代以扩增培养物。为了最佳地维持培养物，用于包装的类器官必须呈现清晰空旷的管腔和清晰的边缘，并且在成熟类器官中观察到的腔内没有黑色碎片。

细胞在一天内附着并形成完全融合的单层，这可以通过大约700圆顶平方厘米的高跨上皮电阻（TEER）得到证实。TEER保持高位三天。肌动蛋白染色表明上皮细胞的顶端侧在 3D 类器官中朝向管腔。

接种在培养插入物中的类器官细胞形成融合的单层上皮细胞，顶端朝向上室。闭塞菌素染色揭示了 3D 类器官和细胞单层中上皮细胞顶端侧的紧密连接。重要的是要记住，用于播种细胞单层的类器官应该看起来清晰，空腔没有对应于死细胞积累的黑色碎片。

来自猪肠道类器官的单层可用于通过使用功能测定、成像和基因表达分析来测试代谢物或微生物对上皮屏障功能的影响。