我们的协议提供了一个快速、可重复和可靠的方法，在不同表面上以最小的碎屑生成直接的原肠道上皮单层。该协议的主要优点是低媒体消费和低成本维护细胞培养。它是一种快速执行功能测试和快速下游应用的方法。

该协议将为研究不同细胞类型的伤口修复、渗透屏障和跨皮迁移提供见解。此外，该模型可用于宿主-病原体相互作用、受损上皮和药物发现。首先，在 48 井板和室滑梯的每口井中添加 200 微升涂层溶液。

在37摄氏度的5%二氧化碳孵化器中预孵化两小时。涂层 0.4 微米细胞膜插入 200 微升胶原蛋白溶液。在 4 摄氏度下用膜插入将板孵化 30 分钟，然后将其转移到 37 摄氏度的 5% 二氧化碳孵化器中，为期两小时。

用70%乙醇对安乐死小鼠进行消毒，然后用剪刀和钳子将结肠从直肠解剖到粪便。用装有20个仪表喂食管的10毫升注射器用冰冷的PBS轻轻冲洗粪便。取出近结肠，轻轻地将分号结肠滑到 20 仪表喂食管上。

用 4-0 丝缝线将管末端的结肠绑起来。将结肠从内到外倒置在绑的末端，用螺纹将另一端绑起来，然后用手术剪刀将结肠切入喂食管尖端以下。使用柱塞轻轻打开倒置冒号的未绑结肠末端到 1.25 毫升重复注射器的尖端。

将倒置结肠的解开端滑动到注射器上，用螺纹将其紧密绑住。将柱塞插入注射器，使结肠充气，直到它看起来结肠结肠结石，没有明显的皱纹。将膨胀的结肠香肠放在一个15毫升的管子里，在冰上含有5毫升的细胞恢复溶液，为期20分钟。

每五分钟充气和放气一次结肠。使用 4-0 丝缝线将重复注射器尖端下方的充气结肠绑起来。将结肠香肠从重复注射器上切下来，放在含有 10 毫升 50 毫升 EDTA 的 15 毫升管中 40 分钟。

在四摄氏度下旋转管子。用五毫升摇床缓冲器替换 EDTA 溶液，在垂直位置手动摇动香肠两分钟。将摇动溶液放入新的 15 毫升管中，重复摇动步骤，直到收集总共 10 毫升的加密和摇动缓冲器。

在显微镜下计算悬架中 20 微升的墓穴数量，稀释样品，以获得每微升 5 个密码的浓度。在4摄氏度下，将加密样品在400倍G下离心10分钟。同时，从孵化器中取出48井板和膜插入物，并将其放置在生物安全柜中。

使用 P200 移液器吸气涂层溶液，将板盖稍稍偏移，直到细胞准备好镀层。离心后，将加密悬架移除摇晃缓冲，并将完整的颗粒重新用三毫升 LWRN 完整介质。在涂层前的 48 井板和室滑梯的每口井中加入 200 微升的墓穴，并在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳孵化器中孵化。

第二天，吸气媒体，增加新鲜媒体。一般来说，细胞在24至48小时内汇总。对于细胞培养膜插入，在插入器顶部添加 200 微升的加密器，在底部添加 600 微升完整的 LWRN 介质。

第二天，吸气媒体，只添加新鲜媒体到顶部室。在37摄氏度的5%二氧化碳孵化器中孵化板。每天使用上皮伏/欧米测量跨皮电阻。

在将墓穴从穆林结肠中分离出来并验证浓度后，墓穴悬架被集中到每微升5个墓穴。48井板井在到达细胞汇合处时受到划伤检测。24小时后，伤口修复观察表明，该文化是健康和可行的。

当媒体从 LWRN 更改为分化媒体时，实现了更高的级别值。此外，还观察到 ISC 标记的减少和分化标记的增加，表明分化单层成功生成。此外，在不同条件下生长的分化上皮细胞的亚型外观也通过免疫荧光表现出来。

在尝试此协议时，重要的是要确保结肠在准备期间的任何时间点不会破裂，并保持充气以在极其干净的准备中释放密码。一旦2d肠道上皮细胞单层形成，我们可以执行免疫荧光，划伤和渗透检测和其他下游应用。这将提供伤口愈合、不同细胞类型迁移以及上皮修复和损伤研究方面的知识。