该协议侧重于使用代谢细胞外通量分析仪量化小鼠和人中性粒细胞以及中性粒细胞样HL60细胞的线粒体呼吸。这种方法使我们能够量化中性粒细胞在正常和疾病条件下的线粒体功能。这是一种简单的技术，可以深入了解细胞对药物或任何疾病状况的线粒体功能。
由于不同的细胞具有不同的线粒体呼吸效率，因此必须准确优化细胞接种密度和试剂浓度才能获得高质量的结果。要开始代谢细胞外通量测定，请取包装在专门设计的96孔板上的传感器盒，并将200微升校准培养基转移到基础板的每个孔中。小心地用校准剂提起滤芯和板，并将其放入非二氧化碳加湿的37摄氏度培养箱中过夜进行水合作用。
接下来，根据细胞类型，在96孔板上涂上特定的涂层，以确保细胞粘附。之后，用200微升无菌PBS清洗板两次。用1毫摩尔丙酮酸，10毫摩尔葡萄糖和2毫摩尔谷氨酰胺制备DMEM中的测定培养基。
按照文本手稿中的描述获取小鼠和人中性粒细胞。对于从小鼠获得的中性粒细胞，通过添加测定培养基将细胞密度调节至每毫升第六个细胞的1.1乘以10至第六个细胞。然后将每孔接种180微升小鼠中性粒细胞悬浮液到制备的96孔板中。
类似地，使用测定培养基将人中性粒细胞密度调节至每毫升10至第六个细胞的2.2倍。在测定当天，使用血细胞计数器手动计数中性粒细胞样HL60细胞。然后将分化或未分化的HL60细胞在室温下以300G离心五分钟。
用DMEM洗涤细胞一次，然后将其重新悬浮在测定培养基中，以达到每毫升10至第六个细胞的1.39倍的细胞密度。接下来将180微升分化或未分化的HL60细胞种子到含有小鼠和人中性粒细胞样品的预先制备的96孔板中。最后，将完全培养基添加到没有细胞的细胞培养板的角孔中，以便在接种时进行背景校正。
在室温下以300G离心板三分钟，以确保板底部的细胞正确粘附。最后，将板孵育一小时，用测定培养基预平衡细胞。打开线粒体压力测试试剂盒，按照制造商的说明准备试剂。
接下来，将试剂盒装入试剂盒，首先将制备的寡霉素装入端口A，将FCCP装入端口B，将鱼藤酮/抗霉素A混合物装入端口C进行注射。用20微升测定培养基填充未使用的端口。在检测前至少五小时在 37 摄氏度下平衡检测系统，方法是打开 Wave 软件并单击“加热器打开”选项卡。
达到温度后，Wave软件的左下角显示准备就绪。在软件中打开线粒体应激测定试剂盒的模板。选择左侧的注射策略，然后单击添加并将注射条件命名为人中性粒细胞或小鼠中性粒细胞或HL60。
通过单击每个端口选择端口 A 到 D，然后单击添加化合物并输入具有相应浓度的寡霉素或 FCCP 或鱼藤酮/抗霉素 A。选择左侧的预处理，然后单击添加并分别命名为CD18和Cell Tak。选择左侧的单元格类型。
然后单击添加并将它们命名为人中性粒细胞、小鼠中性粒细胞和 HL60 或 DHL60，并根据需要提供喂养密度。通过单击添加组来定义组。然后单击带下划线的定义。
单击顶部菜单中的“板图”以观察左侧带有定义的所有组，右侧带有板图。拖放以将每个孔添加到组中，同时保持四个角孔作为背景。要设置实验方案，请选择顶部菜单中的“实验方案”选项卡，并通过将混合时间设置为三分钟、休息时间为零分钟和测量时间为七分钟来定义基线、寡霉素、FCCP、鱼藤酮和抗霉素 A 混合物的三个周期。
转到“运行分析”页，提供项目摘要信息以供参考，然后单击“开始运行”。给出保存文件的位置，以便在测定完成后保存所有结果。然后再次单击开始运行。
自动加载测定后，等待托盘打开，将传感器盒和板放入200微升校准剂。将墨盒条形码方向朝右设置。通过单击“我已准备就绪”运行校准，这大约需要 20 分钟。
校准后，单击打开托盘，用细胞接种板替换板，然后单击我已准备好继续测定。完成测定后，数据将自动保存。将结果导出到电子表格或其他分析软件文件。
绘制图形并分析数据。耗氧率或OCR的代表性动态表明小鼠和人中性粒细胞线粒体呼吸的变化，以及未分化和分化的HL60细胞响应寡霉素，FCCP以及鱼藤酮和抗霉素A的混合物，由于ATP合酶质子通道的抑制，寡霉素处理后所有细胞的OCR值降低。FCCP处理增加了电子流量和氧气消耗，以恢复OCR值并实现最大呼吸。
鱼藤酮和抗霉素A的混合物阻断了电子传递链的复合物1和3，导致线粒体呼吸的消除。中性粒细胞定向分化后HL60细胞中观察到线粒体呼吸减少。发现分化的HL60细胞具有显着降低的基础线粒体呼吸，质子泄漏相关呼吸，ATP连接呼吸和非线粒体呼吸。
分化HL60细胞最大呼吸增加不显著，而备用呼吸能力显著增加。确保细胞位于板的底部，因为在读取 OCR 值时，传感器盒不应因浮动细胞而有任何障碍物。该技术将帮助研究人员研究中性粒细胞相关研究中药物或线粒体功能障碍的影响。
