我们的协议为我们提供了一种方法，在营养和物理环境中研究抗生素耐药细菌，类似于它们可能存在于体内的方式。这项技术的最大优点之一是能够捕获感染相关人群大小的细菌的高分辨率图像和表型数据。这是大约10到1000个细胞的聚合。
演示这个程序的将是亚历克萨·甘农，一个来自我实验室的研究生研究助理。首先，在紫外线下对含粘液的介质进行四个小时的消毒。在无菌条件下将紫外线处理的粘液转移到无菌的 1.7 毫升管中，并将管子储存在零下 20 摄氏度。
准备缓冲基座后，将粘液的库存溶液添加到包含 DNA 的缓冲基座中，如文本手稿中所述。在实验前一天晚上，用含有LB Agar板的抗生素接种5毫升LB肉汤，每分钟搅拌250转。第二天早上，在开始实验前至少两个小时，打开共聚焦激光扫描显微镜，打开相关成像软件中的孵化模块。
将500微升培养物稀释在5毫升新鲜LB肉汤中，并以每分钟37摄氏度和250转的速度孵育细菌悬浮，每次60至90分钟。当细菌进入原木阶段时，通过离心将细菌细胞颗粒化，然后用过滤器消毒PBS清洗细胞三次。最后一次洗涤后，将颗粒重新用一毫升 PBS 重新使用。
测量600纳米细菌细胞悬浮物的吸收量，以确定合成囊性纤维化痰介质介质中等5毫升中0.05的光学密度所需的培养体积。在介质和涡流中轻轻接种细菌细胞悬浮的计算体积，然后在四室光学培养皿的每个腔室中加入一毫升细胞，然后在37摄氏度的静态条件下孵育细菌4小时。通过共聚焦激光扫描显微镜对伪多莫纳斯气管聚集物进行成像，在孵化结束时，指定培养板的三口井作为抗生素治疗复制品，一口井以及一口没有治疗控制，并将板放在显微镜的加热阶段。
选择 63X 油浸入目标并打开定位选项卡以识别明亮油田中的细菌聚合物。定义每个井内的成像区域，并使用位置模块存储区域位置。将激发波长设置为 488 纳米，将发射波长设置为 509 纳米。
在采集模块中，选择 Z 堆栈选项来获取图像，并使用线平均模块来减少 Z 堆栈图像总体积内 GFP 通道中的背景荧光。设置时间系列选项，以 15 分钟间隔在每个井中捕获 60 片，持续 18 小时，并使用明确的对焦策略为每个位置存储一个焦距平面，该位置将在整个实验中每个时间点重新成像。建立成像实验后4-1~2小时，对每个位置进行成像，以确定添加抗生素之前四口井中每个井内的聚合生物量。
六小时后，轻轻加入抗生素，在低于最低抑制浓度的两倍到每个井的中间，只需吹空气液体界面，然后点击开始实验，开始抗生素后治疗成像。为了隔离活细胞，在18小时成像期结束时，根据制造商的建议，给每口井中的细菌贴上适当数量的碘化物标签。在孵化结束时， 使用绝缘容器将板转移到流动细胞计，并设置细胞仪，使用 70 微米喷嘴检测 GFP 和碘化丙胺，然后以最低流量速率运行每个培养物的 1 毫升阿利奎特，对可行的 GFP 阳性和不可行的碘化物阴性伪伪多莫纳斯航空藻聚合物进行排序。
要量化聚合动态，请将图像加载到适当的图像分析软件程序中，并创建 GFP 通道中未处理控制和抗生素治疗培养物产生的计数的直方图，以便量化背景荧光。为确保检测到的 GFP voxel 与细菌生物量相关，将 GFP 阳性 voxel 定义为大于或等于 GFP 背景计数值的 1.5 倍。为所有剩余的 voxels 生成 ISO 表面，并检测单个聚合体，启用拆分对象选项并将聚合体定义为对象。
使用有利模块计算每个对象的 XYZ 体积和 GFP 词汇量。将此数据导出到外部统计平台。按大小过滤输出的数据，以定义体积大于或等于 5 立方微米的对象。
移除小于 0.5 立方微米的对象，并使用有利模块计算每个对象与每个图像中其他对象的距离。或者，可以使用公式计算距离，然后使用总和和平均计算来确定平均总总体积中的生物量总量。虽然在抗生素应用四小时后仍保留着多个可行的细菌聚集物，但与未经治疗的培养物相比，抗生素治疗培养物中总种群的生物量显著减少。
时间系列显微镜可用于确定抗生素治疗后敏感碘化物阳性和耐受GFP阳性聚合物之间的空间模式。通过计算不同大小的聚合物对总人口的贡献，可以确定聚合物对抗生素治疗的反应模式，以相对于其大小、形状和位置。抗生素治疗后，可行和不可行的聚合物可以根据荧光信号表达成功分离。
我们希望这个协议能激励其他研究人员以类似的分辨率研究他们选择的有机体。我们的目标是在这些复杂的社区中找到共同的生物线，无论感染部位如何。
