通过鸡胚胎的腹内移植对肾脏类器官进行有效的血管化

体外培养的肾脏类器官仍然不成熟，限制了它们的适用性。并且这种腔内移植方法诱导血管形成并增强类器官的成熟。该程序非常有效，允许在一次实验中移植和分析大量类器官。

在制备HIPSC衍生的肾脏类器官并孵化受精腿角卵后，在孵化的第三天在蛋壳中创建一个窗口。将一小块透明胶带放在鸡蛋的尖头上。用一把解剖剪刀的锋利末端敲击透明胶带中间的蛋壳，在蛋壳上打一个小孔。

接下来，将 19 毫升注射器上的 45 号针头以 45 度角插入孔中。从卵子中吸出两到三毫升白蛋白，以降低卵子内的胚胎。用第二块透明胶带隐藏孔，然后将一大块透明胶带放在铅笔上，标记为鸡蛋朝上的一侧。

用一把解剖剪刀的锋利末端敲击透明胶带中间的蛋壳，在蛋壳上打一个洞。用弯曲的解剖剪刀从这个洞的蛋壳上剪一个小圆形窗口。通过此窗口查看以找到胚胎。

然后，扩大窗口以优化对胚胎的访问。用镊子去除任何可能落在胚胎顶部的大块蛋壳。用塑料移液管将几滴含有钙和镁的DPBS滴在胚胎上，然后用蛋壳将DPBS吸入移液管中，从而取出较小的碎片。

使用塑料移液管，向鸡蛋中加入三滴DPBS，并补充0.5%青霉素链霉素。用一大块透明胶带小心地密封窗口，然后将鸡蛋放回孵化器中，直到孵化的第 4 天。用弯曲的解剖剪刀从窗户上剪下胶带。

将鸡蛋放在橡胶架或鸡蛋盒上的解剖显微镜下。鸡胚现在处于汉堡-汉密尔顿阶段 23 至 24，左侧躺着，右侧面向观众。找到胚胎的右翼和腿芽，因为将在这两个肢芽之间评估腔肠。

在右翼和腿芽之间的区域，用两对解剖镊子握住它们并轻轻地将它们拉向相反的方向，在卵黄膜、绒毛膜和羊膜上连续开一个开口。检查腔腔是否畅通无阻。用一对解剖镊子轻轻抓住翅膀和肢芽之间的体壁边缘，并将其稍微拉向观察者。

腔腔必须清晰可见。小心地将钝而纤细的器械插入腔腔。使用硬脑膜解剖器将半个类器官放在蛋内尿囊顶部。

使用解剖镊子，小心地抓住体壁的边缘并将其稍微拉向观察者，以使腔肠的开口可见。用钝钨丝和微型手术刀支架轻轻地将类器官移向并通过体壁上的开口进入腔。稍微颅骨推动类器官，使其卡在腔内。

现在在翼芽后面可以看到它。使用塑料移液管将三滴DPBS添加到鸡蛋中。用一大块透明胶带小心地密封窗口，然后将鸡蛋放回孵化器中，直到孵化的第 12 天。

用弯曲的解剖剪刀从窗户上剪下胶带。将鸡蛋放在橡胶架中的解剖显微镜下。评估脉管系统并定位静脉，静脉可通过略亮的红色与动脉区分开来。

为了改善对脉管系统的访问，请用弯曲的解剖剪刀剪开窗户，小心地扩大窗户。选择静脉后，将微毛细管针尖以 0 到 20 度角插入静脉。通过轻轻地将尖端从一侧移动到另一侧来确保针头在静脉中。

轻轻稳定地吹入注射系统以注射晶状体凝集素。然后将鸡蛋放回孵化器中 10 分钟，让它循环。将鸡蛋放入长凳上的橡胶架中。

然后，用弯曲的解剖剪刀切开胚胎周围的膜。用穿孔的勺子从鸡蛋中舀出胚胎，并立即用剪刀将胚胎斩首。在解剖显微镜下，将胚胎的身体放入培养皿中。

将胚胎仰卧在培养皿中并展开四肢。使用镊子沿纵轴小心地打开胚胎的腹壁。在胚胎内找到类器官。

类器官最常附着在右肝叶上，无论是在肋骨尖端还是颅骨。因此，建议从查看这些位置开始。找到类器官后，用微型剪刀将其从胚胎中取出。

将类器官放入鸡组织中，鸡组织不可避免地附着在解剖显微镜下的培养皿中。用双刃不锈钢剃须刀片尽可能多地去除鸡肉组织。非移植肾类器官和移植肾类器官的免疫荧光图像均包含肾小球和肾小管结构。

在未移植的类器官中，存在一些人类内皮细胞。在移植的类器官中，整个类器官中可见灌注的血管网络。盒装区域的放大图像显示了在移植类器官中可以区分的三种类型的内皮细胞:灌注的人内皮细胞、未灌注的人内皮细胞和灌注的鸡源性内皮细胞。

在未移植的类器官中，内皮细胞围绕肾小球结构，但不会侵入它们。然而，在移植的类器官中，肾小球结构通过灌注的毛细血管形成血管化。移植的类器官可以根据实验目的使用不同的技术进行分析。

与未移植对照的直接比较可以深入了解血管形成和成熟过程。