Органоиды почек, культивируемые in vitro, остаются незрелыми, что ограничивает их применимость. А этот метод интрацеломической трансплантации индуцирует васкуляризацию и усиливает созревание органоидов. Процедура очень эффективна, позволяя проводить трансплантацию и анализ большого количества органоидов в одном эксперименте.
После подготовки органоидов почек, полученных из HIPSC, и инкубации оплодотворенные яйца леггорна создают окно в яичной скорлупе на третий день инкубации. Поместите небольшой кусочек прозрачной ленты на заостренный кончик яйца. Сделайте небольшое отверстие в яичной скорлупе посередине прозрачной ленты, постукивая по ней острым концом рассекающих ножниц.
Далее вставьте иглу 19-го калибра на пятимиллилитровом шприце в отверстие под углом 45 градусов. Аспирируйте два-три миллилитра альбумина из яйцеклетки, чтобы опустить эмбрион внутрь яйцеклетки. Скройте отверстие вторым куском прозрачной ленты, затем поместите большой кусок прозрачной ленты на карандаш, отмеченный вверх стороной яйца.
Сделайте отверстие в яичной скорлупе посередине прозрачной ленты, постучав по ней острым концом рассекающих ножниц. Вырежьте из этого отверстия небольшое круглое окошко в яичной скорлупе с помощью изогнутых рассекающих ножниц. Посмотрите в это окно, чтобы найти эмбрион.
Затем увеличьте окно, чтобы оптимизировать доступ к эмбриону. Удалите все большие куски яичной скорлупы, которые могли упасть на эмбрион, с помощью щипцов. Удалите более мелкие кусочки, поместив несколько капель DPBS с кальцием и магнием на эмбрион с помощью пластиковой пипетки для переноса, а затем аспирировав DPBS с яичной скорлупой в пипетку.
С помощью пластиковой пипетки для переноса добавьте в яйцеклетку три капли DPBS, дополненного 0,5% пенициллиновым стрептомицином. Тщательно закройте окно большим куском прозрачной ленты, прежде чем поместить яйцо обратно в инкубатор до четвертого дня инкубации. Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами.
Поместите яйцо под препарирующий микроскоп на резиновый держатель или картонную коробку для яиц. Куриный эмбрион сейчас находится на стадии Гамбургера-Гамильтона с 23 по 24 и лежит на левом боку, а правый бок обращен к зрителю. Найдите правую почку крыла и ноги эмбриона, так как целома будет оцениваться между этими двумя почками конечностей.
В области между правым крылом и почкой ноги последовательно создайте отверстие в вителлинной мембране, хорионе и амнионе, удерживая их двумя парами рассекающих щипцов и осторожно потянув их в противоположных направлениях. Проверьте, есть ли беспрепятственный доступ к целомической полости. Аккуратно возьмитесь за край стенки тела между почкой крыла и лимба парой рассекающих щипцов и слегка потяните его к зрителю.
Целомическая полость должна быть хорошо видна. Осторожно вставьте тупой, но тонкий инструмент в целомическую полость. Поместите половину органоида внутрь яйца поверх аллантоиса с помощью диссектора твердой мозговой оболочки.
С помощью рассекающих щипцов осторожно возьмитесь за край стенки тела и слегка потяните его к зрителю, чтобы было видно отверстие в целом. Осторожно переместите органоид к отверстию в стенке тела и через него в целомум с помощью тупой вольфрамовой проволоки и держателя микроскальпеля. Слегка подтолкните органоид к черепу, чтобы поместить его внутрь целяка.
Теперь он виден сразу за почкой крыла. Добавьте три капли DPBS в яйцо с помощью пластиковой пипетки для переноса. Тщательно закройте окно большим куском прозрачной ленты, прежде чем поместить яйцо обратно в инкубатор до 12 дня инкубации.
Отрежьте ленту от окна изогнутыми рассекающими ножницами. Поместите яйцо под препарирующий микроскоп в резиновый держатель. Оцените сосудистую сеть и найдите вены, которые можно отличить от артерий по их немного более яркому красному цвету.
Чтобы улучшить доступ к сосудистой сети, аккуратно увеличьте окно, разрезав его изогнутыми рассекающими ножницами. Выбрав вену, вставьте кончик иглы микрокапилляра в вену под углом от нуля до 20 градусов. Убедитесь, что игла находится в вене, осторожно перемещая кончик из стороны в сторону.
Осторожно и неуклонно подуйте в систему впрыска, чтобы ввести в линзу culinaris агглютинин. И поместите яйцо обратно в инкубатор на 10 минут, чтобы оно циркулировало. Поместите яйцо в резиновый держатель на скамейке.
Затем прорежьте мембраны, окружающие эмбрион, изогнутыми препарирующими ножницами. Зачерпните эмбрион из яйца перфорированной ложкой и сразу же обезглавьте эмбрион с помощью ножниц. Под диссекционным микроскопом поместите тело эмбриона в чашку Петри.
Поместите эмбрион на спину в чашку Петри и раздвиньте конечности. Аккуратно вскрывают брюшную стенку эмбриона по продольной оси с помощью щипцов. Найдите органоид внутри зародыша.
Органоид чаще всего прикрепляется к правой доле печени, либо на кончике лапки, либо краниально, чуть ниже грудной клетки. Итак, желательно начать с просмотра этих мест. Как только органоид будет найден, удалите его из эмбриона, разрезав его микроножницами.
Поместите органоид в куриную ткань, которая неизбежно прикрепляется к ней, в чашку Петри под препарирующим микроскопом. Удалите как можно больше куриной ткани с помощью обоюдоострого бритвенного лезвия из нержавеющей стали. Иммунофлуоресцентные изображения нетрансплантированного органоида почки и трансплантированного органоида почки содержат клубочковые и канальцевые структуры.
В нетрансплантированных органоидах присутствуют некоторые эндотелиальные клетки человека. В пересаженном органоиде перфузированная сосудистая сеть видна по всему органоиду. Увеличенные изображения коробчатых областей демонстрируют три типа эндотелиальных клеток, которые можно различить в трансплантированных органоидах: перфузированные эндотелиальные клетки человека, неперфузированные эндотелиальные клетки человека и перфузированные эндотелиальные клетки, полученные из курицы.
В нетрансплантированных органоидах эндотелиальные клетки окружают клубочковые структуры, но не вторгаются в них. Однако в трансплантированных органоидах клубочковые структуры васкуляризируются перфузированными капиллярами. Трансплантированные органоиды могут быть проанализированы с использованием различных методов в зависимости от цели эксперимента.
Прямое сравнение с нетрансплантированными контрольными группами может дать представление о процессе васкуляризации и созревания.
