我们感谢加拿大农业和农业食品部为这项研究提供的资金（项目 J-001843 和 J-002021）。我们感谢 Brett van Heyningen 为本协议拍摄视频内容。我们还要感谢以前的研究生（Jennifer Vacon 和 Mark Nabuurs）对本手稿中描述的方法的见解。

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。
1. 选择微生物生物防治候选者
<ol><li>使用竞争板检测，选择对目标病原体表现出拮抗作用的微生物分离物。 注：选择了 9 种表现出对菌核链球菌拮抗作用的芽孢杆菌分离株，包括萎缩芽孢杆菌、莫哈文菌和枯草芽孢杆菌物种，以证明该方案。</li>
</ol>2. 培养基制备
<ol><li>通过每升水溶解 39 g 培养基来制备马铃薯葡萄糖琼脂 （PDA）。</li>
	<li>通过每升水添加 45 g 培养基来制备假单胞菌 F 琼脂。</li>
	<li>通过每升水添加 24 g 培养基和 0.24 g 琼脂，制备含有 1% 琼脂的马铃薯葡萄糖汤 （PDB）。</li>
	<li>准备酵母-葡萄糖-锰 （YGM） 肉汤。制备由 2.5 g KH2PO4 和 2.5 g K2HPO4 溶于 100 mL 水的缓冲溶液，以及由 0.58 g MnSO4 组成的盐溶液。H20、0.5 g NaCl 和 0.05 g FeSO 4.7H20 溶于 100 mL 水中。<ol><li>接下来，加入 1 g 酵母提取物、1.25 g 葡萄糖、400 mL 水、5 mL 缓冲溶液、5 mL 盐溶液和 90 mL 水，以确保金属盐不会在溶液中沉淀。</li>
	</ol></li>
	<li>对培养基进行高压灭菌，将琼脂倒入 100 x 15 mm 培养皿中，并在使用前全部冷却至室温。</li>
</ol>3. 病原体制备
<ol><li>在 PDA 上培养五板菌核 病 菌（在步骤 2.1 中制备），并在 25 °C 下孵育 3 天。</li>
</ol>4. 天然产物提取物制备
<ol><li>在假单胞菌 F 琼脂（在步骤 2.2 中制备）上培养每个细菌分离物并生长直至观察到单个菌落。</li>
	<li>将单个细菌菌落传代培养到离心管或培养管中的 25 mL YGM 培养基中，并在振荡下孵育 3 天。</li>
	<li>将每种提取物的 5 mL 等分试样转移到 1 L YGM 中，并在相同条件下再孵育 3 天。</li>
	<li>将每种培养物在 25 °C 下以 3000 x g 离心 15 分钟以沉淀细胞。</li>
	<li>倒出并用乙酸乙酯洗涤上清液 3 次，以从培养基中提取代谢物。</li>
	<li>合并并使用旋转蒸发干燥每个乙酸乙酯层。</li>
	<li>将提取物重新溶解在最少的甲醇中，将其转移到一个小闪烁瓶中，然后通过旋转蒸发再次干燥。 注：如果提取物干燥成油性或树脂状材料，请将材料冻干以获得可准确称量的干粉。</li>
</ol>5. TLC 板制备
<ol><li>通过在距板底部 20 厘米和距板顶部 2 厘米处画一条线来准备 20 厘米 x 20 厘米的 TLC 板。在底线上，放置 9 个点，相距 2 厘米。在顶线上方，放置四个相距 4 厘米的点。</li>
	<li>将 5 mg 每种提取物溶解在 15 μL 甲醇中，并使用移液管将 5 μL 每种提取物涂抹在底线上标记的九个点上。让每个提取物点在 TLC 板上干燥，然后将另外 5 μL 等分试样涂到同一点。重复直到所有材料都加载到 TLC 板上。</li>
	<li>使用二氯甲烷和甲醇的 1：2 溶液在显影槽中显影 TLC 板，直到溶剂到达距板顶部 2 cm 标记的线（约 45 分钟）。</li>
	<li>显影后，取出 TLC 板，并在溶剂线上方标记的四个点上涂抹一系列阳性对照。使用相同对照的四种浓度。对于 S. scl.， 0.5 μg/mL、5 μg/mL、50 μg/mL 和 500 μg/mL 潮霉素 B 是阳性对照。</li>
	<li>在所有溶剂从板中蒸发之前，将其放入乙醇灭菌的 TLC 板盒中。</li>
</ol>6. 直接生物自闭造影测定
<ol><li>将用于测定的材料（色谱喷雾器的玻璃成分、金属刮刀、四张纸巾、纤维素或滤纸、水和培养基）在覆盖有锡纸的大烧杯中高压灭菌。 注意：纸质材料（纸巾、纤维素纸）应用锡箔包裹，以避免在高压灭菌器中受潮。</li>
	<li>使用乙醇灭菌的 PTFE 管连接气源、压力表和色谱喷雾器。在色谱喷雾器和压力表之间连接 HEPA 过滤器。</li>
	<li>使用无菌金属刮刀将五个病原体板的菌丝垫收集到使用无菌刮刀的 50 mL 离心管中。 注意：如果需要，使用少量液体肉汤帮助去除菌丝体，并使用无菌移液管转移。</li>
	<li>将 25 mL 用琼脂和无菌玻璃珠修饰的 PDB 添加到 50 mL 离心管中，涡旋 5 分钟以打碎菌丝垫。</li>
	<li>使用带有针尖的无菌注射器将菌丝体悬浮液转移到层析喷雾器中，以确保大块菌丝体不会堵塞层析喷雾器。</li>
	<li>将先前开发的 TLC 板放在层流罩中的无菌纸巾上，以减少在应用培养基悬浮液时手与板的接触。</li>
	<li>将气压增加到大约 4 巴，并在 TLC 板上涂上三层悬浮液，让板在两次应用之间完全干燥。 注意：发现三层是最佳量。小于这个值，病原体就没有足够的培养基来生长。不仅如此，培养基太厚，可能不允许病原体与活性代谢物接触。</li>
	<li>将 500 mL 无菌水加入消毒过的塑料板盒中，并在每侧放置消毒过的折叠纤维素片或滤纸以保持水分。</li>
	<li>将完成的分析板放在盒子中的四个空培养皿上。</li>
	<li>孵育测定 3 天至 1 周，或直到均匀的菌丝体层在 TLC 板上均匀生长，阳性对照和抑制区 （ZOI） 周围除外。</li>
</ol>7. 液相色谱质谱分析
<ol><li>使用摄影对完成的分析进行成像。</li>
	<li>通过将底线到 ZOI 的距离除以底线到底线的距离来计算每个抑制区的保留因子。</li>
	<li>从抑制区刮下二氧化硅，并将其放入微量离心管中。</li>
	<li>向每个试管中加入 500 μL 甲醇并涡旋以从二氧化硅中提取代谢物。</li>
	<li>在 20 °C 下以 8,500 x g 离心 10 分钟，然后将上清液转移到一个小瓶中。</li>
	<li>通过旋转蒸发或在氮气流下蒸发至干。</li>
	<li>将提取物重悬于 LC 样品瓶中的 50 μL 甲醇中。</li>
	<li>通过 LC-MS 分析抑制区的代谢物，并将其与粗提取物中的代谢物进行比较，以确定粗提取物中的哪些代谢物负责抑制病原体16。</li>
	<li>使用 ZOI 中鉴定的源微生物的属和种以及质量，搜索文献和相关数据库（如 Antibase 和 Dictionary of Natural Products）以鉴定代谢物。</li>
</ol>

使用 TLC-Direct 生物自闭造影测定鉴定用于生物控制的天然产物

<ol>
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Susan Boyetchko 博士在提交这项工作之前（2023 年 2 月 8 日）去世。所有其他作者均已声明没有利益冲突。

TLC-DB 是一种有价值且成熟的 NP 研究工具，是微孔板生物测定指导分离方法的一种简单且廉价的替代方案17。与需要使用液相色谱技术分离代谢物的微孔板分析相比，它需要最少的时间和材料资源。它是一种高度通用的检测方法，除了酶抑制剂 18,19,20,21,22,23 外，还可用于检测抗菌、抗真菌、抗寄生虫和抗氧化 NP。虽然最常用于检测和鉴定生物活性植物化学物质，但与本协议18 中探讨的相同的方法可以应用于细菌 NP。此外，该方案可以针对各种 NP 来源和目标病原体进行优化，以帮助发现和评估新型生物活性 NP。
用于细菌生长的培养基和用于提取的溶剂会极大地影响天然产物的发现结果。该方案中使用的培养基针对产生环状脂肽的细菌进行了优化，包括假单胞菌和芽孢杆菌属。 但是，如果探索其他属，应考虑其他培养基和营养来源。人们可以选择使用在一系列培养基中生长的相同微生物来完成 TLC-DB，以评估一种分离物代谢物多样性的全部广度，或者对更广泛的分离株使用相同的生长条件。萃取溶剂的选择也会影响检测到的天然产物。通常了解到，大多数生物活性 NP 具有低到中等极性，这使得乙酸乙酯成为合适的选择，因为它的沸点低，易于去除。但是，如果还希望检查极性和非极性馏分，则可以使用其他溶剂进行多次萃取。或者，可以将游离提取物冻干并用于检测中，以查看释放到培养基中的所有代谢物。然而，通常需要将更多材料加载到 TLC 板上，以考虑冻干材料中的干燥培养基成分。同样，如果该方法与不同的病原体（例如接种物）一起使用，则必须优化使用的培养基和孵育条件，以获得用于 TLC-DB 测定的 5 个菌丝体琼脂平板。
与接触和浸入式生物自闭造影相比，TLC-DB 具有优势，因为它使用最薄的琼脂和接种物层，最大限度地减少了对代谢物扩散到琼脂层的依赖，这可以允许少量的天然产物诱导病原体抑制17。先前发表的使用 TLC 生物自传方法的研究结果使用病原体的孢子悬浮液来完成测定17。尽管这确实允许精确控制悬浮液浓度，但诱导某些真菌的孢子形成可能非常困难和耗时24。这种修改大大简化了测定，并允许使用难以孢子化且以前可能避免用于该方法的真菌病原体完成测定。
检测中使用的细菌提取物的质量会影响结果。如果 TLC 板上的提取物太少，则可能不会超过活性化合物的最低抑制浓度，并且不会检测到生物活性。因此，在某些情况下，如图 1 和 图 2 所示，值得使 TLC 板过载，从而牺牲分离以轻松检测活性。同样，喷洒到板上的病原体负荷不能太低，因为没有足够的培养基来支持病原体生长。该方法可以很容易地进行调整以适应各种细菌提取物和病原体，并且方案中概述的微生物提取物和接种物的数量确保了可以检测多种病原体和微生物提取物的生物活性。如果在检测完成后未观察到抑制区，则可能表明存在以下情况之一。首先，由于不相容的培养基用于细菌生长或由于细菌的活性不是 NP 产生的结果，因此所施用的提取物中可能不存在活性代谢物。可以完成提取物的纸片扩散测定，以确认或否认提取物中存在活性 NP。如果纸片扩散测定显示没有病原体抑制，则可以测试其他培养基以确定其他条件是否产生生物活性 NP。如果纸片扩散测定确实表明提取物抑制了病原体，则可能需要将更大质量的细菌提取物应用于 TLC 板，在这种情况下，可以尝试另一种测定。
将 ZOI 中的代谢物与粗提取物进行比较对于鉴定活性 NP 至关重要。在检测中，粗提取物中的代谢物可以被病原体代谢或修饰，这可以通过 LC-MS 进行观察。因此，只有粗提取物和 ZOI 中都存在的代谢物才能被视为所研究细菌产生的 NP。如果无法将从 ZOI 中提取的代谢物与粗提取物中的代谢物相关联，则可以制备 TLC 板，如步骤 5 所述。在不完成生物自相测定的情况下，以完成测定中观察到的相同保留时间从 TLC 板中提取代谢物。这应该允许 ZOI 中的代谢物与粗提取物之间更容易关联，从而导致病原体抑制。
TLC-DB 的一个缺点是 TLC 的分辨率远低于使用传统微孔筛选技术时获得的分辨率，后者需要液相色谱法进行分离。因此，多种代谢物通常存在于抑制区，其中某些代谢物可能对生物活性没有贡献。为了更清楚地观察生物活性而使 TLC 板过载的做法可能会进一步导致此问题。最近的工作是使用高性能 TLC （HP-TLC） 发表的，它大大提高了分辨率，并且可以实现 TLC 开发的自动化，这在使用传统 TLC 时是不可能的 14,21,22,23。此外，可以在第二维 （2D-TLC） 中开发板，以进一步分离具有相似保留时间的代谢物。话虽如此，我们应该评估增加的时间和材料成本是否值得从 HP 和 2D-TLC25 获得更高的分辨率。

真菌农业病原体对全球作物质量和产量造成重大损失，加剧了稳定的全球食品生产系统的经济和供应挑战 1,2。通过培育抗感染的栽培品种并使用综合作物管理系统（包括作物轮作和土地管理实践）来抑制病原体增殖，可以防止病原体损害 3,4。虽然这些方法减少了对作物的损害，但化学杀虫剂通常结合使用，以主动杀死田间的真菌生殖结构，并进一步防止损害和减产。虽然有效，但化学杀虫剂的使用有许多缺点，包括破坏周围生态系统、土壤肥力下降、相关的人类健康风险以及病原体耐药性的发展，后者导致每年需要更高剂量的杀虫剂 5,6,7。
长期以来，基于微生物的害虫和病原体管理产品一直被认为是合成杀虫剂的潜在替代品或补充。自 1900 年代初以来， 苏云金芽孢杆菌 已被广泛用于控制农业害虫和病原体，作为种子处理剂、叶面喷施和直接土壤处理8。此类产品被命名为生物杀虫剂，其特征是天然存在的微生物或生化物，可以杀死、抑制或降低目标害虫或病原体的活力。生物农药可以通过各种机制控制病原体的生长，但最常见的是通过分泌次生代谢物来实现9。次生代谢物，通常被称为天然产物，不参与初级代谢，而是作为一种进化优势产生的，以超越其他微生物10。
与合成农药相比，生物农药具有许多优势。与合成害虫管理产品相比，它们对环境、动物和人类的毒性风险较低 9,10。由于大多数生物农药在环境中自然存在了数千年，因此环境中存在微生物代谢物的生物降解途径，限制了土壤或生态系统污染的可能性，并缩短了导致合成农药对环境造成如此破坏的停留时间11。此外，许多用于减轻病原体感染的生物农药也表现出促进植物生长的特性，这可以提高养分生物利用度并诱导植物系统性抗性12。
最常见的是，生物杀虫剂以微生物接种物的形式施用，NP 由活微生物原位分泌 12,13。在这种情况下，确定生物杀虫剂活性的来源具有很大的价值。这样做可以深入了解生物农药的作用机制，有助于为通过专利保护微生物建立案例，并且如果它们的结构新颖，则可以产生重大的科学影响。然而，最重要的是，生物活性来源的鉴定为下游生物农药产品的配方提供了信息。如果 NP 本身具有活性，则可以将微生物用作生物分子工厂，用于大规模生物农药生产。此外，许多已探索用于生物防治的 NP 在人类医学中也有潜在的应用，使其更具经济价值8。
薄层色谱-直接生物自闭法 （TLC-DB） 测定是一种廉价且直接的生物活性引导分离和鉴定生物农药代谢物的方法。虽然该技术通常用于从粗植物提取物中分离植物化学物质的生物活性测试，但它在微生物提取物分析方面也具有巨大潜力14。TLC 可快速且廉价地分离粗微生物提取物中的 NP，并且在用培养基病原体悬浮液包被后，很容易看到含有活性代谢物的区域。可以从板中刮下这些区域，然后通过超高效液相色谱-质谱联用 （UPLC-MS） 提取用于化学分析，以鉴定已知的代谢物。与先前报道的化合物不匹配的代谢物 可以通过液相 色谱法大量分离，以使用核磁共振波谱和 X 射线晶体学等技术进行结构解析研究15。
本文描述了一种使用 TLC-DB 与 芽孢杆菌 属和农业病原体 菌核病菌核瘤来发现和鉴定生物农药 NP 的模型系统。 图 1 提供了 TLC-DB 程序的示意图概述。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig01.jpg"> 图 1：TLC-DB 程序步骤 4-7 的示意图概述。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5-5 mL single channel Pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11020-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Thin Layer Chromatography Sprayer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>KT422530-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 x 15 mm Petri plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89038-970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#181;L pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76322-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-1000 &#181;L single channel pipette</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76169-240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-918</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 L glass bottle</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>CLS13951L</td>
			<td>Must be autoclave safe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL sterile syringe with needle</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>8935L75</td>
			<td>Detachable needle is recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL Microcentrifuge tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>87003-298</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11020-008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7 mL scintilation vials</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76538-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A412-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>UZ-01850-34</td>
			<td>8 L, 115 VAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacteriological agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97064-336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bin</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1216H91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9230-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichloromethane &#8805;99.8% ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1113-4LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate &#8805;99.8% ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1123-4LG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28297-846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grinding Beads</td>
			<td>VWR</td>
			<td>12621-148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin B</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA80501-074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iron Sulfate Heptahydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow hood</td>
			<td>CleanTech</td>
			<td>1000-6-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS</td>
			<td>Waters</td>
			<td>LITR10064178</td>
			<td>UPLC/MS/MS TQD system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>700201000</td>
			<td>Temperature collector&#160;-50 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manganese Sulfate Hydrate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CAAA10807-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol &#8805;99.8% ACS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH2018-5GLP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towel</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89402-824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA90000-758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potato Dextrose Broth</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA90003-494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potsasium Phosphate Dibasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potsasium Phosphate Monobasic</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470302-252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Gauge 6mm Union Straight 0-10 bar (0-145 psi)</td>
			<td>Tameson</td>
			<td>F25U6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudomonas F Agar</td>
			<td>VWR</td>
			<td>90003-352</td>
			<td>Also known as Flo Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE Tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>58697-U</td>
			<td>1/16 inch inner diameter&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9286-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatula</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Inoculation loops with needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76534-512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tinfoil</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1086F24</td>
			<td>Can be purchased from supermarket</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S 25 Glass Plates 20 X 20 cm</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1205Q12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Pump</td>
			<td>Labconco</td>
			<td>1472100</td>
			<td>98 L/min</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76549-928</td>
			<td>Must accomadate 15 mL and 50 mL centrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman in-line HEPA-VENT</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>WHA67235000</td>
			<td>10 filters, 1/4 to 3/8 inch inlet/outlet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-370</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioassay-guided identification of natural products for biocontrol by thin layer chromatography-direct bioautography

薄层色谱-直接生物自闭法 （TLC-DB） 是一种成熟的生物测定法，用于分离和鉴定对目标病原体具有拮抗作用的天然产物 （NP）。这是一种快速、廉价且简单的选择，用于生物测定指导下分离和鉴定 NP，取决于 TLC 分离以及直接应用目标病原体来检查生物活性。它通常用于分析生物活性植物提取物，检测对细菌、真菌和酶的抑制活性。话虽如此，它在细菌 NP 发现方面具有巨大潜力，特别是用于评估细菌 NP 对相关农业病原体的免疫力，这对于发现和开发用于农业的新型生物农药很有价值。此外，它是一种可调方案，可应用于有关生物活性化合物发现和鉴定的研究计划中的其他目标病原体或 NP 来源。在此，我们描述了一个模型系统，用于使用 TLC-DB 与 芽孢杆菌 属和农业病原体 菌核病菌核瘤来发现和鉴定生物农药 NP。

Fungal agricultural pathogens cause significant losses in crop quality and yields worldwide, contributing to the economic and supply challenges of a stable global food production system1,2. Pathogen damage can be prevented by breeding cultivars resistant to infection and using integrated crop management systems, including crop rotations and land management practices to suppress pathogen proliferation3,4. Though these methods reduce damage to crops, chemical pesticides are generally used in tandem to actively kill fungal reproductive structures in the field and further prevent damage and yield reductions. Although effective, chemical pesticide usage has many drawbacks, including damage to surrounding ecosystems, a decline in soil fertility, associated human health risks, and the development of pathogen resistance, the latter causing higher doses of pesticides to be required each year5,6,7.
Microbial-based pest and pathogen management products have long been considered potential alternatives or complementary to synthetic pesticides. Since the early 1900s, Bacillus thuringiensis has been widely used to control agricultural pests and pathogens as a seed treatment, as a foliar spray, and in direct soil treatment8. Such products have been named biopesticides and are characterized as naturally occurring microorganisms or biochemicals that can kill, suppress, or reduce the vigor of a target pest or pathogen. Biopesticides can control the growth of a pathogen through various mechanisms but most commonly do so through the secretion of secondary metabolites9. Secondary metabolites, often referred to as natural products, are not involved in primary metabolism but are produced as an evolutionary advantage to outcompete other microorganisms10.
Biopesticides offer many advantages over their synthetic counterparts. They pose a low toxicity risk to the environment, fauna, and humans compared to synthetic pest management products9,10. Since most biopesticides have existed naturally in the environment for millennia, biodegradation pathways for microbial metabolites exist in the environment, limiting the possibility of soil or ecosystem contamination and reducing residence times that contribute to synthetic pesticides being so environmentally destructive11. Additionally, many biopesticides used for mitigating pathogen infection also exhibit plant growth-promoting properties, which can increase nutrient bioavailability and induce plant systemic resistance12.
Most commonly, biopesticides are applied in the form of microbial inoculum, and NPs are secreted by live microorganisms in situ12,13. In such a case, identifying the source of the activity of a biopesticide is of great value. Doing so provides insight into the mechanism of action of the biopesticide, aids with building a case for the protection of a microorganism with a patent, and can have a significant scientific impact if their structures are novel. Most importantly, however, identification of the bioactive source informs formulation possibilities for a downstream biopesticide product. If the NP itself is active, one can use the microorganism as a biomolecule factory for large-scale biopesticide production. Additionally, many NPs that have been explored for biocontrol also have potential applications in human medicine, making them even more economically valuable8.
Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) assays are an inexpensive and straightforward method for the bioactivity-guided isolation and identification of biopesticidal metabolites. Although the technique is commonly used for separating bioactivity testing of phytochemicals from crude plant extracts, it also has great potential for the analysis of microbial extracts14. TLC provides fast and inexpensive separation of NPs in a crude microbial extract, and after coating with a media pathogen suspension, zones that contain active metabolites are easily visualized. Those zones can be scraped from the plate and extracted for chemical analysis by ultra-high-performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UPLC-MS) to identify known metabolites. Metabolites that do not match previously reported compounds can be isolated in larger quantities via liquid chromatography to undergo structure elucidation studies using techniques such as nuclear magnetic resonance spectroscopy and X-ray crystallography15.
This article describes a model system for discovering and identifying biopesticide NPs using TLC-DB with Bacillus spp. and the agricultural pathogen Sclerotinia sclerotiorum. Figure 1 provides a schematic overview of the TLC-DB procedure.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic overview of steps 4-7 of the procedure of TLC-DB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

作者聚焦：从生物活性土壤微生物衍生的天然产品中发现新的生物农药

生物测定 - 通过薄层色谱法 - 直接生物自闭法鉴定用于生物防治的天然产物

通过 TLC 分离微生物提取物后，代谢物应沿 TLC 板垂直分散。在可见光下，可能很难看到在可见光范围内不吸收的代谢物。因此，在紫外光下成像可以帮助查看代谢物的分离，如图 2A、B 所示。 孵育期后，病原体应在整个板中均匀生长，除了阳性对照和活性代谢物所在的抑制区，如图 2C 所示。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66967/66967fig02v2.jpg"> 图 2：通过 TLC 分离微生物提取物。 （A） 开发的 TLC 板包含九种 芽孢杆菌 提取物，在可见光下成像，（B） 在施用真菌接种物之前在 320 nm 紫外光下成像。（C） 完成生物自发分析，在整个板中观察到病原体生长，除了阳性对照周围生长受到抑制的地方，以及每种提取物的 ZOI。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66967/66967fig02largev2.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
通过 LC-MS 分析从抑制区提取的代谢物，并与粗提取物进行比较，以确定负责拮抗病原体的 NP。匹配的代谢物应具有相同的保留时间和分子离子种类，才能被视为匹配。一旦鉴定出活性代谢物，就可以批量培养细菌培养物，以分离感兴趣的活性代谢物，用于结构化学或生物学研究。

我们描述了使用薄层色谱、直接生物自闭测定法和液相色谱-质谱法来识别使用病原体菌核 病 菌和生物 农药芽孢 杆菌分离株作为模型系统来识别对真菌病原体表现出拮抗作用的微生物天然产物。

Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) is a well-established bioassay used to separate and identify natural products (NPs) that are ...

bioassay-guided-identification-natural-products-for-biocontrol-thin

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography

809 次观看.  Agriculture and Agri-Food Canada. 在农业中，关于发现合成杀虫剂替代品的研究在过去二十年中取得了显著增长。通过检查生物活性土壤微生物产生的天然产物，我们的团队设想发现环境中已经存在的新生物杀虫剂。层析直接生物统计法或 TLCDB 主要用于确定植物提取物对病原菌和真菌的生物活性。在本视频中，无需诱导病原体变质即可对细菌提取物进行检测，从而可以检查更?...

视频: 作者聚焦：从生物活性土壤微生物衍生的天然产品中发现新的生物农药

Thin layer chromatography-direct bioautography (TLC-DB) is a well-established bioassay used to separate and identify natural products (NPs) that are antagonistic against a target pathogen. It is a rapid, inexpensive, and simple option for the bioassay-guided isolation and identification of NPs that hinges on separation by TLC coupled with the direct application of a target pathogen to examine bioactivity. It is typically used for the analysis of bioactive plant extracts, detecting inhibitory activity against bacteria, fungi, and enzymes. That being said, it has great potential in bacterial NP discovery, particularly for evaluating bacterial NPs against pertinent agricultural pathogens, which is valuable for discovering and developing novel biopesticides for the agriculture industry. Furthermore, it is a tunable protocol that could be applied to other target pathogens or sources of NPs in research programs concerning the discovery and identification of bioactive compounds. Herein, we describe a model system for discovering and identifying biopesticide NPs using TLC-DB with Bacillus spp. and the agricultural pathogen Sclerotinia sclerotiorum.

We describe the use of thin-layer chromatography direct bioautography assay and liquid chromatography-mass spectrometry to identify microbial natural products that display antagonism against fungal pathogens using the pathogen Sclerotinia sclerotiorum and biopesticidal Bacillus isolates as a model system.