通过测量人纯化血小板中的磷脂酰丝氨酸暴露和微泡释放来表征促凝血小板

血小板促凝物的形成对于维持止血至关重要。这个过程涉及血小板表面磷脂的表达和微泡的释放，这对于凝血步骤至关重要。对这一过程的评估提供了关于血小板促凝血反应在不同人类疾病中如何的新数据。

流式细胞术一直是磷脂酰丝氨酸表达的基石，在评估磷脂酰丝氨酸在血小板和微泡释放中的表达方面已获得广泛认可。从血液中分离和分析纯化的血小板非常耗时，并且需要专门的实验室设备，因此目前无法用于常规临床诊断。分析磷脂酰丝氨酸暴露和微泡释放也具有挑战性，因为它们体积小且目标标志物的阳性事件数量少。

首先，在含有活性抗凝剂柠檬酸三钠、柠檬酸和葡萄糖的收集管中收集外周静脉血。轻轻倒置试管，使血液与抗凝剂混合，让混合物在室温下静置 15 分钟。使用自动细胞计数仪对血小板进行计数，以确定正确的离心速度。

要制备富含血小板的血浆，请在室温下以 250 g 离心血液 10 分钟，不要休息。然后将 1 毫升 ACDA 和 6.25 微升双磷酸腺苷双磷酸酶添加到 9 毫升富含血小板的血浆中。在室温下以 1， 100 g 离心混合物 10 分钟。

使用 Pasture 移液器，去除含有贫血小板血浆的上清液，并将血小板沉淀轻轻重悬于 1 毫升洗涤缓冲液中。然后向试管中加入 3 至 4 毫升洗涤缓冲液并再次离心。去除上清液后，将沉淀重悬于 1 毫升洗涤缓冲液中。

将 150 μL 血小板悬液转移到 1.5 mL试管中，以便在自动细胞计数仪中对细胞进行计数。如前所述，向剩余的悬浮液中加入 3 至 4 mL 洗涤缓冲液，以进行额外的洗涤。接下来，将血小板沉淀重悬于反应缓冲液中，以达到 5 x 10 的最终浓度，达到每升 11 个血小板的幂。

首先，在所需的缓冲液中获得洗涤的血小板以进行流式细胞术。在反应缓冲液中准备所有激动剂和荧光染料。对于内部分析，将 100 微升浓度为 50 x 10 的洗涤血小板以每升 9 个血小板的功率添加到不同的处理管中。

轻轻摇晃每个等分试样，并在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。然后向每个微管中加入 5 微升未稀释的 Annexin V-FITC 并孵育。然后，向每个试管中加入 500 μL 反应缓冲液以停止该过程。

使用前向散射或 FSC 对血小板群体进行门控，并使用密度图独立识别每个群体。将负临界值设置在静息态血小板种群的最右侧。激活后，将此截止值右侧的事件分类为暴露磷脂酰丝氨酸的血小板。

为了区分微泡，将临界值设置为在静息血小板群中观察到的最低 FSC 值。激活后，将低于此阈值的磷脂酰丝氨酸阳性事件分类为微泡。基线测量表明，不到 2.9% 的未活化血小板表现出磷脂酰丝氨酸暴露。

激活后，26.7% 的血小板胶原蛋白、9.1% 的凝血酶和 36.2% 的胶原蛋白和凝血酶均呈阳性。离子载体处理导致 49.6% 磷脂酰丝氨酸阳性血小板。微泡的基线比例为 0.3%仅观察到胶原蛋白和凝血酶一起增加约 11.4%，而离子载体则更多，为 44%