La formation de procoagulant plaquettaire est cruciale pour maintenir l’hémostase. Ce processus implique l’expression des phospholipides et la libération de microvésicules à la surface des plaquettes, ce qui est essentiel pour les étapes de coagulation. Les évaluations de ce processus ont fourni de nouvelles données sur la façon dont les réponses procoagulantes plaquettaires sont dans diverses maladies humaines.
La cytométrie en flux a été une pierre angulaire et a été largement acceptée dans l’évaluation de l’expression de la phosphatidylsérine sur la libération de plaquettes et de microvésicules. L’isolement et l’analyse des plaquettes purifiées à partir du sang prennent du temps et nécessitent de l’équipement de laboratoire spécialisé, et ne sont donc pas actuellement disponibles pour le diagnostic clinique de routine. L’analyse de l’exposition à la phosphatidylsérine et de la libération de microvésicules est également difficile en raison de leur petite taille et du faible nombre d’événements positifs pour les marqueurs d’intérêt.
Pour commencer, prélevez du sang veineux périphérique dans des tubes de prélèvement contenant l’anticoagulant actif citrate trisodique avec de l’acide citrique et du dextrose. Retournez doucement le tube pour mélanger le sang avec l’anticoagulant et laissez reposer le mélange à température ambiante pendant 15 minutes. Comptez les plaquettes à l’aide d’un compteur de cellules automatisé pour déterminer la vitesse correcte de centrifugation.
Pour préparer le plasma riche en plaquettes, centrifugez le sang à 250 g pendant 10 minutes à température ambiante sans appliquer la pause. Ajoutez ensuite 1 millilitre d’ACDA et 6,25 microlitres d’apyrase à 9 millilitres de plasma riche en plaquettes. Centrifuger le mélange à 1,100 g pendant 10 minutes à température ambiante.
À l’aide d’une pipette de pâturage, prélever le surnageant contenant du plasma pauvre en plaquettes et remettre doucement la pastille plaquettaire en suspension dans 1 millilitre de tampon de lavage. Ajoutez ensuite 3 à 4 millilitres de tampon de lavage dans le tube et centrifugez-le à nouveau. Après avoir retiré le surnageant, remettez la pastille en suspension dans 1 millilitre de tampon de lavage.
Transférez 150 microlitres de suspension plaquettaire dans un tube de 1,5 millilitre pour compter les cellules dans un compteur de cellules automatisé. Ajoutez 3 à 4 millilitres de tampon de lavage à la suspension restante pour effectuer un lavage supplémentaire comme démontré précédemment. Ensuite, mettez à nouveau en suspension la pastille de plaquettes dans le tampon de réaction pour obtenir une concentration finale de 5 x 10 à la puissance 11 plaquettes par litre.
Pour commencer, obtenez des plaquettes lavées dans le tampon souhaité pour la cytométrie en flux. Préparez tous les agonistes et fluorochromes dans le tampon de réaction. Pour les dosages internes, ajoutez 100 microlitres de plaquettes lavées à une concentration de 50 x 10 à la puissance 9 plaquettes par litre dans différents tubes de traitement.
Agitez doucement chaque aliquote et incubez à 37 degrés Celsius pendant 5 minutes. Ajoutez ensuite 5 microlitres d’Annexin V-FITC non dilué dans chaque microtube et incuberez. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de tampon de réaction dans chaque tube pour arrêter le processus.
Identifiez la population plaquettaire à l’aide de la diffusion vers l’avant ou FSC et utilisez des graphiques de densité pour identifier chaque population indépendamment. Réglez le seuil négatif à l’extrême droite de la population de plaquettes à l’état de repos. Après activation, classez les événements à droite de cette coupure comme des plaquettes exposant la phosphatidylsérine.
Pour différencier les microvésicules, réglez le seuil à la valeur FSC la plus basse observée dans la population de plaquettes au repos. Après activation, classer les événements positifs à la phosphatidylsérine en dessous de ce seuil comme des microvésicules. Les mesures de base ont indiqué que moins de 2,9 % des plaquettes non activées présentaient une exposition à la phosphatidylsérine.
Lors de l’activation, 26,7 % des plaquettes sont devenues positives à la phosphatidylsérine avec le collagène, 9,1 % avec la thrombine et 36,2 % avec le collagène et la thrombine. Le traitement ionophore a donné 49,6 % de plaquettes positives à la phosphatidylsérine. La proportion de base de microvésicules était de 0,3 %Des augmentations significatives ont été observées uniquement avec le collagène et la thrombine ensemble à environ 11,4 % et plus encore avec les ionophores à 44 %
