活/死染色，用于定量麦卢卡蜂蜜处理的伤口致病细菌中的活细胞但不可培养的细胞

本研究项目旨在调查麦卢卡蜂蜜对细菌生理学的影响。最近的研究为麦卢卡蜂蜜对细菌生理学的抗菌作用提供了进一步的见解。我们的初步结果表明，麦卢卡蜂蜜细菌进入抗生素耐药、有活力但不可培养的休眠状态，但程度低于用常规抗生素处理的细菌。

根据我们的实验，比较麦卢卡蜂蜜和常规抗生素诱导的 VBNC 的表达谱会很有趣。首先，取含有冷冻细菌菌株的小瓶。依次打开每一个，并使用无菌棒将少量冷冻细菌刮到适当标记的 Luria-Bertani 或 LB 琼脂平板上。

装回样品瓶盖并迅速将其放入冰箱中。将细菌培养物在 37 摄氏度下孵育 18 至 24 小时。第二天，使用血清移液管将两毫升 LB 肉汤转移到两个无菌试管中。

在本生灯火焰中对接种环进行消毒。然后将四分之一环的细菌从 LB 琼脂平板转移到适当标记的含有 LB 肉汤的试管中。在有氧条件下，将试管置于摇动培养箱中，以约 250 RPM 的速度在 37 摄氏度下孵育 18 至 24 小时。

对于麦卢卡蜂蜜的设置和细菌的抗生素处理，将 10 微升细菌培养物添加到 10 毫升 Mueller Hinton 肉汤中，以获得细菌培养物的 1：1， 000 稀释度，每毫升大约有 10 到第六个菌落形成单位。使用稀释的培养物为每种细菌种类制备三个样品，一个未处理的对照样品，一个麦卢卡蜂蜜处理的样品和一个抗生素处理的样品。将麦卢卡蜂蜜和抗生素加入适当的试管中。

将 0.1 毫升和 0.5 毫升未处理的样品转移到无菌微量离心管中，用于活板计数和 T 等于零样品的活/死染色。然后将未处理的对照、麦卢卡蜂蜜和抗生素处理的样品在 37 摄氏度的好氧条件下，在振荡培养箱中以 250 RPM 的温度孵育 24 小时。在 LB 肉汤中制备 T 的 10 倍连续稀释液，等于零未处理样品，以获得用于活平板计数的可计数细胞数。

将 50 μL 的每种稀释样品涂在 LB 琼脂平板的一半上。在 37 摄氏度的需氧条件下孵育琼脂板 24 小时。第二天，从培养箱中取出 LB 琼脂平板。

确定包含大约 25 至 150 个菌落的稀释板，并计算菌落的确切数量。使用菌落形成单位公式确定每毫升可培养细胞的数量。第 3 天，将 0.5 毫升 0.85% 氯化钠添加到 0.5 毫升 T 中，等于 0 个未经处理的活/死染色对照样品为零。

每个样品混合 1.5 μL SYTO 9 和 1.5 μL 碘化丙啶。然后向每个样品中加入 3 微升混合物。将样品在 21 摄氏度下避光孵育 15 分钟。

将 6 μL 染色、轻轻混合的样品转移到一次性血细胞计数器中，并使用异硫氰酸荧光素或 FITC 滤光片和 40 倍物镜在荧光显微镜下观察。捕获显示血细胞计数器网格线和绿色细胞的图像。对每个样品 6 个字段中的绿色细胞进行计数，注意网格尺寸以计算每个体积的绿色细胞数。

最后，通过将使用活/死染色获得的每毫升活细胞数减去使用活板计数获得的每毫升可培养细胞数来计算活细胞但不可培养细胞的数量。第四天，从培养箱中取出未处理、麦卢卡蜂蜜处理和抗生素处理的细菌培养物后，将每个样品的 0.1 毫升和 0.5 毫升收集到微量离心管中，以进行活板计数和活/死染色。该图显示了使用金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌培养物的活板计数和活/死染色确定的可培养细胞和活细胞的数量。

结果表明，在未处理和麦卢卡蜂蜜处理的培养物中检测到的活细胞和可培养细胞的数量没有显著差异。用妥布霉素处理的金黄色葡萄球菌培养物的可培养细胞比活细胞少，但这种差异并不显著。与活细胞相比，只有美罗培南处理的铜绿假单胞菌显示出可培养细胞的统计学显着减少。