atp 利用商业检测和染色法定量检测淋病奈瑟菌骨料的抗生素敏感性

这项技术使我们能够在临床上更相关的条件下测量抗生素易感性。该技术还使我们能够确定真正的抗生素浓度，可以杀死细菌的聚合。此技术可用于确定消除 GC 聚合所需的浓度。

该方法还可用于测量任何能够形成聚集体细菌的抗菌易感性。注意解解步骤，确保解解完成。否则，ATP 测量检测将低估可行细菌的数量。

此方法的可视化将允许其他研究人员遵循并复制此实验的一致性。首先条纹Neisseria淋病，或GC菌株，在GCK阿加上补充1%凯洛格在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育16至18小时。第二天早上，使用光学显微镜仔细选择没有暗边或皮利阳性菌落的皮利阴性菌落，从每个板块中条纹采摘的菌落到新的GCK板，在37摄氏度和5%的二氧化碳下进行16至18小时的培养。

第二天早上，使用无菌施用器从每个盘子中收集GC菌落，并在热汤中重新涂抹每个棉签，并辅以4.2%碳酸氢钠和1%凯洛格溶液。测量 650 纳米（OD650）的光学密度，以确定悬浮细菌的浓度，并调整GC浓度，将每毫升形成8个菌落单位约10倍。接下来，将99微升GC悬浮液加入96孔板的个别井中，使细菌在37摄氏度和5%的二氧化碳下聚集6小时。

在孵化结束时，在每口油井中加入一个连续稀释的西夫特里亚松微升，使一些油井未经处理，以作为控制，并将板再返回孵化器24小时。第二天，在每只井中，每井的悬浮液三次，功率为144瓦，每次声波5秒，并在每井中加入100微升的商用ATP利用发光试剂。小心地将每口井的 150 微升混合物转移到新的 96 孔黑色微孔板的单个孔中，并在板读卡器上测量每口井 560 纳米的吸光。

然后，根据连续抗生素治疗后获得的读数与未处理油井读数的比率计算存活率。要可视化活/死GC聚合，使用无菌施用器从隔夜培养的板收集GC，并在预谋的GCP介质中重新暂停GC，并辅以1%Kellogg。通过分光光度测量OD650，将浓度调整为每毫升7个菌落形成单位的1倍左右。

接下来，将198微升GC悬浮液加入8个井盖唇底室，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育6小时。在孵化结束时，每组聚集条件用两微升的西夫特里亚松处理细菌，并在适当的实验孵化期将腔室返回到孵化器。在孵化结束时，将0.6微升活/死染色溶液加入到每一个井中，并将腔室返回孵化器，再加20分钟。

然后，使用共和显微镜获取 z 系列图像。要测量 GC 聚合的大小，请在 ImageJ 中打开第一个图像，并选择手绘线来圈出图像中每个聚合的区域。单击分析和测量。

聚合的大小将在区域列下指示。要量化每个聚集体中活染色和死染色的荧光强度比，请单击分析和设置测量值，并检查弹出窗口中的集成密度。单击"确定"并单击图像、颜色和通道工具。

选择颜色和通道一作为死细菌染色的荧光。选择徒手线来圈出每个聚集区，然后单击分析和测量，以获得集成密度列中每个聚集的荧光强度比。选择活细菌染色荧光通道二，并测量每个聚集体中的荧光强度，正如刚刚演示的。

然后将活荧光强度数据除以死荧光强度数据，获得活荧光强度比。在这个具有代表性的实验中，非聚合皮利阳性、聚合皮利阳性或聚合和干扰皮利阳性细菌在测量其ATP水平之前，用连续稀释的西夫特里亚松进行治疗。预聚合GC表明，当处理与同浓度相等的西夫特里亚松或更高时，存活率明显高于非聚合或聚合中断的GC。

与突变菌株相比，形成较大聚集的皮利阳性菌株在西夫特里亚松治疗后表现出最高的 ATP 水平。无论经检测出的菌株，抗生素治疗前的活/死染色都暴露出死菌主要位于培养的外层，而活体GC主要在西夫特里亚酮处理的集料核心内识别。正如所料，皮利阳性细菌形成最大的聚集物，而皮利-阴性培养物形成最小。

值得注意的是，在抗生素治疗后，皮利阳性的聚合体仍然存活在其核心层中，而小型松散突变体中的GC则死亡。根据GC的大小和存活率，可以绘制一个相关图来研究细菌的聚集大小和抗生素存活率之间的关系。声波对于确保来自每个细菌的 ATP 在紧密约束的聚集体内释放非常重要。

否则，测量值将不一致。重要的是在细菌聚集并用抗生素治疗后对细菌进行板板，以测量可行细菌和具有复制能力的细菌。该技术测量细菌聚集对抗生素易感性的影响，使研究人员能够开发更好的治疗疾病的药物。