Reprograming Model of Human Monocyte-derived Macrophages for In-vitro Assays

我们的研究调查了单核细胞和巨噬细胞谱系，强调其卓越的可塑性和整合来自环境的多个信号以塑造炎症、组织修复和感染过程中效应反应的能力。巨噬细胞遍布全身，协调先天免疫和适应免疫的启动和消退，影响受保护和免疫介导的病理。重编程巨噬细胞是该领域最有前途的特征。

新兴的组学技术彻底改变了我们对巨噬细胞生物学的理解，提供了对其表型多样性、功能特征、编程潜力和这些细胞的发育起源的见解。发现巨噬细胞分化和极化的主要障碍和陷阱是文献中异质的实验条件和方案，以及在定义巨噬细胞术语方面缺乏共识。我们证明了药物和脂质介质对巨噬细胞极化的重编程作用，并开发了巨噬细胞和胶质母细胞瘤细胞之间相互作用的 3D 体外模型。

此外，我们已经表明血小板允许单核细胞衍生的巨噬细胞分化为 N1 表型。首先，将抗凝外周血样品放入离心机中。在室温下将其旋转至 200G 15 分钟。

观察顶部富含血小板的血浆和下方细胞组分（包括红细胞和白细胞）的分离。用预热至室温的无菌 PBS 稀释从第一次离心中获得的细胞组分。在进行 Ficoll-Hypaque 密度梯度离心之前，轻轻匀浆溶液。

将 15 mL Ficoll-Hypaque 转移到无菌的 15 mL 试管中。小心缓慢地在 Ficoll 上加入 30 毫升稀释的血液，确保各相之间的混合最小。将含有 Ficoll 和稀释血液的试管以 600G 离心，在室温下离心 25 分钟。

使用无菌的 3 ml 巴斯德移液管，去除一些黄色顶层。用无菌巴斯德移液器小心收集黄色层和 Ficoll 层之间的界面。将收集的外周血单核细胞 （PBMC） 转移到含有至少 3 毫升无菌 PBS 的新 15 毫升试管中。

用无菌 PBS 加满试管，使总体积达到 12 至 15 毫升。然后将样品以 600G 离心 10 分钟。接下来，在 8 至 10 摄氏度下以 300G 离心 PBMC 悬浮液 5 分钟。

将细胞重悬于所需体积的含 2% FBS 的无菌冷 PBS 中。将细胞保持在 4 摄氏度，直到下一步。将所需体积的 PBMC 悬浮液转移到 5 mL 聚苯乙烯圆底管中。

然后为每 100 μL 细胞悬液添加 10 μL 阳性选择混合物。充分混合悬浮液，然后在室温下孵育 15 分钟。接下来，每 100 微升细胞悬液吸取 10 微升磁性纳米颗粒。

用力上下移液五次以上，以确保磁性纳米颗粒的均匀悬浮。在室温下孵育 10 分钟后，向悬浮液中加入含有 FBS 和 EDTA 的 PBS，使总体积达到 2.5 mL。轻轻地上下移液细胞两到三次。

将试管插入磁力分选仪，静置 5 分钟。以一个连续的运动将磁铁与管子一起倒置。将磁铁和管子倒置 2 到 3 秒钟，然后将它们恢复到直立位置。

从磁铁上取下试管，然后再次向试管中加入 2.5 毫升 PBS-FBS-EDTA 缓冲液。轻轻上下移液细胞悬液 2 到 3 次以混合。将试管插回磁力架中，并放置 5 分钟。

在一个连续的动作中，再次倒置磁力架和试管，丢弃上清液部分。从磁力架上取下试管，并将细胞重新悬浮在适当体积的不含 EDTA 的 PBS-FBS 中。肯定选择的单元格现在可以使用了。

现在将 PBS-FBS 缓冲液添加到分选的 CD14 细胞中，使总体积达到 12 至 14 毫升，以稀释任何剩余的 EDTA。以 600G 离心 10 分钟。弃去上清液后，将阳性选择的 CD14 单核细胞重悬于 2 毫升 PBS-FBS 缓冲液中。

使用自动细胞计数器对细胞进行计数。将细胞保持在冰上，直到培养物制备。对于培养，将沉淀以每毫升 100 万个细胞的浓度重悬于补充的 RPMI 1640 培养基中。

将 250 微升制备的细胞悬液移液到 48 孔板的每个孔中。向每个孔中加入 250 微升补充抗生素的 RPMI 培养基，每毫升含有 50 ng巨噬细胞集落刺激因子。在加湿培养箱中孵育细胞培养板以启动巨噬细胞分化。

在巨噬细胞分化的第 4 天，从每个孔中更换一半的培养基。添加细胞因子或试剂以达到所需的极化条件，并继续培养 3 天。在第 7 天收获巨噬细胞衍生的单核细胞用于表型表征。

干扰素 γ 加脂多糖诱导的 M1 巨噬细胞表现出 CD64 最高表达，CD206 缺失，CD163 和 MERTK 水平低。白细胞介素 4 诱导的 M2a 巨噬细胞的特征是 CD206 表达增加，CD64 、 CD163 和 MERTK 水平降低。白细胞介素 10 或地塞米松诱导的 M2c 巨噬细胞表现出 CD163 和 CD14 表达增加，CD64 的中等水平和 MERTK 表达增加。